表达流行性感冒病毒血凝素蛋白的重组腺病毒的构建

病毒学报 2000年第3期第16卷 论　著—人与动物病毒

作者：张立国　郭元吉　温乐英　曾革非　王敏　董婕　郭俊峰　石长信　张智清

单位：中国预防医学科学院病毒学研究所，北京 100052

关键词：流感病毒；血凝素；重组疫苗；腺病毒载体；粘膜免疫

　　摘要：用RT-PCR方法扩增流感病毒血凝素基因，将其克隆到5型腺病毒载体质粒pAd5C中。用此质粒与EcoRI酶切回收的5型腺病毒基因组大片段共转染293细胞，通过PCR初步筛选得到重组病毒。SDS-PAGE电泳、Western blot证明重组病毒能表达流感病毒的血凝素蛋白。此重组病毒经滴鼻免疫Balb／C小鼠，ELISA实验证明能诱导小鼠产生针对流感病毒的循环抗体IgG和分泌型抗体IgA。本实验证明，利用E3区缺失的5型腺病毒载体可以用来表达流感病毒血凝素抗原，重组抗原具有良好的免疫原性，有可能发展成为基因工程流感疫苗。

　　中图分类号：R373.1^＋3；Q784 　　文献标识码：A

　　文章编号：1000－8721（2000）03-0203-04

Construction of Recombinant Adenovirus Expressing Influenza Virus Haemagglutinin

ZHANG Li-guo，GUO yuan-ji，WEN Le-ying，ZENG Ge-fei，WANG Min，

　　dONG Jie，GUO Jun-feng，SHI chang-xin，ZHANG Zhi-qing（Institute of Virology, CAPM, Beijing 100052, China）

　　Abstract: The HA gene of influenza virus A1/PR8/34 was amplified by RT-PCR and cloned into the shuttle plasmid pAd5C. The constructed plasmid and the largest fragment of adenovirus type 5 genome DNA digested by EcoR I were cotransfected into 293 cells. Recombinant virus was selected by PCR. The expression of HA gene in the cells infected with recombinant virus was identified by SDS-PAGE and Westen blot. Mice immunized with the recombinant virus by nasal route can produce HA specific antibody both in serum and on mucosal surface. The Ad5 vector with E3 region deletion can be used as a vector to construct the recombinant influenza virus vaccine.

　　Key words: influenza virus; haemagglutinin; adenovirus vector; recombinant vaccine; mucosal immunity

　　流行性感冒（流感）病毒是危害人类健康重要病原之一，每年都引起不同程度的流感流行。仅在本世纪就曾出现了4次世界性的大流行，给社会经济造成了难以估量的损失。目前预防流感主要采取灭活流感疫苗肌肉注射的方法，但多年的临床实验表明这并不能提供满意的保护，有时保护率低于50％^［1－4］。流感灭活疫苗免疫效果差的原因是多方面的，但非常重要的一点是由于免疫途径不合适。流感病毒在人群中主要是通过呼吸道传播的，它侵害上呼吸道时出现与其它病原所引起的普通感冒相同的症状。如果病毒侵犯了下呼吸道，那么就会出现一系列严重的全身性反应，严重者还可导致死亡。研究表明，呼吸道粘膜表面的分泌型IgA在阻止病毒感染中也占有重要的地位，它能抑制病毒的粘附，是机体保护机制中的第一道屏障^［5，6］，而肌肉注射的灭活疫苗主要诱导产生血清IgG，不能刺激机体产生粘膜免疫。因此，如何改进流感疫苗，使其既能诱生血清IgG又能诱导粘膜免疫，产生分泌型IgA，是流感疫苗研究的难点和重点之一。

　　由于腺病毒能通过消化道和呼吸道途径感染，在诱导产生粘膜免疫方面具有优势。本研究中利用5型腺病毒载体构建了能表达流感病毒的血凝素抗原的重组病毒，旨在为发展基因工程流感疫苗打下基础。

　　材料与方法

　　1　病毒和抗体　流感病毒A1／PR8／34毒株、小鼠抗A1／PR8／34的多克隆抗血清由国家流感中心保存。辣根过氧化物酶羊抗小鼠IgG为军事医学科学院产品。羊抗小鼠的IgA为Sigma公司的产品。pGME-T载体为Promega公司的产品。

　　2　细胞及质粒　293和HeLa细胞由病毒学研究所病毒形态研究室提供。质粒pAd5C^［7］和腺病毒基因组DNA由石长信教授惠赠。

　　3　工具酶及其它试剂　病毒RNA提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒为Invitrogen公司产品。Taq酶、反转录酶为Boehringer Mannheim公司的产品。内切酶为Takara或Bio-lab公司的产品。

　　4　引物的设计合成　根据流感病毒A1／PR8／34血凝素基因全长序列设计两条引物：PR8HA-1：5＇-gc tct ag aaa atg aag caa acc ta ct-3＇；PR8HA-2：5＇-acg cca gct gca tat ttc tga aat tct aat-3＇。基因5＇端引物设有XbaI位点，3＇末端设有SalI位点。此外设计两对引物供检测重组病毒使用。一对为HA基因内部引物，其扩增长度约为300bp；另一对为腺病毒引物，其序列为5＇-tcg ttt ctc agc agc tgt tg-3＇和5＇-cat ctc taa ctc aaa gcg tgg-3＇，扩增长度约为800bp。

　　5　流感病毒HA基因的克隆　提取病毒RNA，用PR8HA-2引物反转录后进行PCR扩增，反应条件为94℃30s，50℃60s，72℃30s，30个循环后，72℃延伸5min。回收PCR产物与pGME-T连接，转化DH5α受体菌。

　　6　重组病毒的构建与筛选　用XbaI和SalI双酶切从pGEM－T／HA上回收HA基因片段，亚克隆到腺病毒载体pAd5C中。用EcoRI酶切AD5基因组DNA，琼脂糖电泳后用透析袋回收3个片段中的最大的片段，通过脂质体（GIBCO BRL）将回收的大片段与pAd5C／HA共转染293细胞。收集转染后细胞，3次冻融之后接种HeLa细胞，48h收获病变的细胞，冻融3次后离心去除细胞碎片，取上清作为模板进行PCR检测。野生型腺病毒感染的HeLa细胞采用同样方法处理后作为阴性对照。

　　7　重组病毒表达HA抗原的鉴定　PCR检测阳性的重组病毒在HeLa细胞上进行空斑纯化，然后扩大培养，48h收获病变的细胞，冻融3次后离心去除上清，收集细胞碎片，进行SDS-PAGE电泳观察血凝素基因的表达情况。用小鼠抗流感病毒的多克隆血清进行Western blot鉴定。

　　8　动物免疫　采用8周龄的Balb／C小鼠，乙醚麻醉之后通过鼻腔吸入重组病毒（10⁶PFU／只），以野生型腺病毒作为阴性对照。免疫4周后腋窝采血，放血处死小鼠，收集血清。然后暴露小鼠的气管，从喉头部位切开，用注射器接上毛细塑料管从喉头部插入，以1ml PBS（含有1％牛血清白蛋白）注入小鼠的下呼吸道，反复冲洗3次，此为肺洗液。

　　9　抗体检测　以纯化的流感病毒包被酶标板4℃过夜，将收集的免疫鼠的血清和肺洗液样品做不同的稀释度后，分别用辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG或羊抗小鼠IgA37℃作用1h，OPD显色后，2mol／L硫酸终止反应。测定OD₄₉₀的光吸收度。当实验组与对照组OD值之比大于2.0的最大稀释度判为抗体的滴度。

　　结　　果

　　1　流感病毒HA基因的克隆以及穿梭质粒的构建

　　以病毒RNA为模板进行RT－PCR扩增，得到一个1.7kb左右的片段，序列测定证明为A1／PR8／34病毒HA基因。将其克隆进入pGEM－T载体中，将酶切鉴定正确的重组质粒命名为pGEM－T／HA。然后用XbaI和SalI双酶切，回收HA基因，将其亚克隆到腺病毒载体pAd5C中，挑取阳性克隆命名为pAd5C／HA。酶切鉴定如图1。

图1　酶切鉴定穿梭质粒pAd5c／HA

　　Figure 1　Identification pAd5c/HA by endonuclease digestion

　　1. pGEM-T/HA XbaI+Sal I; 2. pAd5c/HA XbaI+Sal I; 3. RT-PCR products of HA gene from A1/PR8/34; 4. DL 15000 marker.2　重组病毒的筛选与鉴定

　　共转染后的293细胞冻融之后接种HeLa细胞，可以导致典型的细胞病变，细胞变圆，膨大，最后脱落，与野生腺病毒病变相似。流感病毒HA基因两对引物能从病变细胞的上清中扩增出1.7kb和300bp大小的片段。腺病毒的引物扩增片段长度约为800bp，与预期扩增长度相符。而以野生型腺病毒为模板时，只有腺病毒的引物能扩增出相应的片段（图2）。

图2　PCR鉴定重组病毒

　　Figure 2　Identification of recombinant virus by PCR

　　1, 2, 3. Wild type adenovirus as template; 5, 6, 7. Recombinant adenovirus as template; 1, 5. Primers for full length of HA gene; 2, 6. Inner primers of HA gene; 3, 7. Primers for adenovirus; 4. DL 2000 marker.

　　3　重组病毒表达HA抗原的检测

　　重组病毒和野生型腺病毒感染HeLa细胞碎片经SDS－PAGE电泳发现，重组病毒感染的细胞表达比野生型腺病毒感染的细胞在43kD和66kD间有一条表达带，与流感病毒血凝素蛋白的分子量接近，Western blot鉴定能与流感病毒的抗血清发生特异性反应。证明重组病毒能够表达流感病毒的血凝素抗原。

图3　重组病毒中HA基因表达的检测

　　Figure 3　Detection of HA expression in the recombinant adenovirus infected HeLa cells by sDS-PAGE and Western blot

　　1. HeLa cells infected with wild type adenovirus; 2. HeLa cells infected with recombinant adenovirus; 3. Marker.

图4　重组病毒免疫之后流感病毒抗体滴度

　　Figure 4　Influenza antibody titer of recombinant adenovirus immunized mice

　　4　动物免疫实验

　　重组病毒和野生型腺病毒免疫小鼠4周后，其血清和肺洗液的ELISA检测表明，重组病毒免疫能诱导小鼠产生对流感病毒的抗体，表现为血清中和肺洗液中都含有抗流感病毒的IgG和IgA（图4）。因此证明重组腺病毒所表达的血凝素抗原有良好的免疫原性，并能刺激产生粘膜免疫。

　　讨　　论

　　与其它的病毒载体相比较而言，腺病毒载体有许多优点，例如安全性与稳定性好，宿主细胞种类广泛，可以感染非复制性的细胞等。因此腺病毒载体目前广泛应用于基因工程疫苗的研究。腺病毒载体应用最多的是E1区缺失和E3区缺失两种。E3区的表达产物19.3kD的糖蛋白，能够与新生的MHC I结合，阻止其到达细胞的表面，从而影响机体细胞免疫系统对腺病毒的免疫监视作用，E3区的缺失可以增强机体对外源抗原的免疫反应。在基因工程载体中将此基因缺失，从理论上讲可以增强外源蛋白的抗原性，更好刺激机体的免疫保护反应。E1区是病毒复制的必需区，因此缺失此区的腺病毒载体只能在特定的细胞株如293上增殖。E1区的编码蛋白E1A具有多种功能，其中之一是能诱导细胞转化。因此认为它有潜在的致瘤性。但是有E1区整合的293细胞并未永生化，可以通过口服途径诱导免疫保护，在临床上腺病毒的自然感染以及应用腺病毒的弱毒疫苗并未发现其有致瘤作用。有关E1区致瘤的作用还有待于更进一步的探讨。

　　利用腺病毒载体表达狂犬病膜蛋白的重组疫苗显示，E3区可以通过口服方式进行免疫，E1区缺失的重组病毒则不能通过口服方式免疫^［8，9］。两种载体在流感病毒中的应用还有待于进一步的实验证实。

　　血凝素抗原是流感病毒最主要的保护性抗原，血凝抑制抗体的水平与病毒中和抗体的水平呈正相关。因此在本实验中采用血凝素基因来构建重组病毒。滴鼻免疫后抗体检测表明，既可以刺激小鼠产生循环抗体，又可以刺激产生分泌型抗体，实验结果表明，肺洗液中的IgG的滴度高于IgA。Katz^［10］等也得到了相同的结果。关于肺洗液中IgG水平为何如此之高，还有待于进一步研究。

　　作者简介：张立国（1971－），男，河北人，博士研究生，研究流感病毒。

　　参考文献：

　　［1］Grotto I, Mandel Y, Green M S, et al. Influenza vaccine efficacy in young, healthy adults［J］. Clin Infect Dis, 1998, 26: 913-917.

　　［2］Carrat F, Tachet A, Rouzioux C, et al. Field investigation of influenza vaccine effectiveness on morbidity［J］. Vaccine, 1998, 16: 893-898.

　　［3］Conne p, Gauthey L, Vernet P, et al. Immunogenicity of trivalent subunit versus virosomeformulated influenza vaccines in geriatric patients［J］. Vaccine, 1997, 15: 1675-1679.

　　［4］Nicholson K G. Immunization against influenza among people aged over 65 living in Leicestershire during winter 1991-1992［J］. BMJ, 1993, 306: 974-976.

　　［5］Clements M L, Betts R F, Tierney E L, et al. Serum and nasal wash antibodies associated with resistance to experimental challenge with influenza A wild-type virus［J］. J Clin Microbiol, 1986, 24: 157-160.

　　［6］Reneagar K B, Amall p A. Immunoglobulin A mediation of murine nasal anti-influenza virus immunity［J］. J Virol, 1991, 65: 2146-2148.

　　［7］石长信，周伟，温乐英，等. 5型腺病毒载体的构建［J］.中华实验和临床病毒学杂志，1999，13：76.

　　［9］Xiang Z Q, Yang Y P, Wilson J M. A replication-defective human adenovirus serves as a highly efficacious vaccine［J］. Virology, 1996, 219: 220-227.

　　［9］Prevec L, Campbell J B, Christite B S, et al. A recombinant human adenovirus vaccine against rabies［J］. J Infect Dis, 1990, 161: 27-30.

　　［10］Katz J M, Lu X H, young S A, et al. Adjuvant activity of the heat-labile enterotoxin from enterotoxigenic Escherichia coli for oral administration of inactivated influenza virus vaccine［J］. J Infect Dis, 1997, 175: 352-363.

收稿日期：2000－01－31；修回日期：2000－03－01