雌激素对卵巢癌细胞株体外生长的影响

中华妇产科杂志 2000年第3期第35卷 论著

作者：杨毅　 沈铿　 郎景和

单位：杨毅（100730 中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院妇产科）；沈铿（100730 中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院妇产科）；郎景和（100730 中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院妇产科）

关键词：卵巢肿瘤；雌激素替代疗法；雌二醇

　　【摘要】　目的　探讨17-β雌二醇(E₂)对卵巢癌细胞株体外生长和细胞周期的影响。方法　采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法和流式细胞术（FCM）的方法，观察了卵巢癌细胞株CAOV3和OVCAR3在加入含有不同浓度17-β E₂培养液后细胞活性和细胞周期的变化；同时采用免疫组化方法，测定癌细胞在加入17-β E₂前后雌激素受体表达的变化。结果　 （1）浓度为0.25～5.00 nmol/L的17-β E₂，可轻度抑制卵巢癌细胞株的生长，抑制率为6.3％～36.0％。（2）17-β E₂可使CAOV3细胞株中G₀及G₁期的细胞由55.0％减少为19.0％～30.0％，S期的细胞由30.0％增加到52.0％，G₂及M期的细胞由14.0％增加到17.0％～28.0％；使OVCAR3细胞中G₂及M期的细胞由37.0％减少为22.0％～30.0％，S期的细胞由31.0％增加到38.0％～51.0％。17-β E₂对G₀及G₁期的OVCAR3细胞没有明显的影响，加入17-β E₂前为32.0％，加入17-β E₂后为29.0％～31.0％。（3）卵巢癌细胞株CAOV3和OVCAR3均为雌激素受体阳性细胞株，加入17-β E₂对其雌激素受体的表达没有明显影响。 结论　 雌激素对卵巢癌细胞株CAOV3 和OVCAR3没有刺激其生长的作用, 相反可轻度抑制CAOV3和OVCAR3细胞的生长，可能是雌激素通过细胞的雌激素受体改变了细胞的生长周期。

　　Influence of Estrogen on the Epithelial Ovarian Cancer Cell Lines in Vitro

YANG Yi, SHEN Keng, LANG Jinghe.

　　Department of Obstetrics and Gynecology, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100730, China

　　【Abstract】　Objective　To study the effect of 17-β estradiol on the growth of the epithelial ovarian carcinoma cell lines in vitro. Methods　The proliferative capacity of the ovarian carcinoma cell lines CAOV3 and OVCAR3 in the cultrue medium with 17-β estradiol was evaluated by the means of the mircocultrue tetrazolium assay (MTT) and cell kinetics was analyzed by flow cytometry (FCM). The expression of estrogen receptor (ER) of the two cell lines was examined by the immunohistochemical staining. Results　 The growth of both two epithelial ovarian cancer cell lines was slightly inhibited by 17-β estradiol (0.25～5.00 nmol/L), and the inhibitive rate was 6.3%～36.0%. FCM showed that the kinetics of the two cell lines were obviously changed. Comparing with the kinetics of CAOV3 without estradiol, the cell rate of Stage G₀/G₁ of CAOV3 with estradiol decreased from 55.0% to 19.0%～30.0%, cell rate of Stage S increased from 30.0% to 52.0%, cell rate of Stage G₂/M increased from 14.0% to 17.0%～28.0%; In OVCAR3, cell rate of Stage G₂/M decreased from 37% to 22.0%～30.0%, cell rate of Stage S increased from 31.0% to 38.0%～51.0%, cell rate of Stage G₀/G₁ did not changed much (cell rate without estradiol was 32.0%, while cell rate with estradiol 29.0%～31.0%). Estrogen receptors of the two cell lines were positive and not changed after cultured in the medium with 17-β estradiol. Conclusion　The proliferate capacity of the two epithelial ovarian cancer cell lines CAOV3 and OVCAR3 can be inhibited by the estrogen (0.25～5.00 nmol/L), possibly through the change of the tumor cell kinetics.

　　【Key words】　Ovarian neoplasms;Estrogen replacement therapy； Estradiol

　　近年来，卵巢癌患者术后使用雌激素替代治疗受到临床的重视，但其安全性问题一直未能得到解决。许多学者对此进行了多方面的研究，但至今未得出一致的结论^［1-8］。本研究采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法、流式细胞术、免疫组织化学和放射免疫分析等方法，分析了卵巢癌细胞株CAOV3和OVCAR3于体外加入不同浓度的17-β雌二醇（E₂）培养液前后，细胞活性、周期、受体等指标变化,以探讨雌激素对卵巢癌细胞体外生长和周期的影响，为临床卵巢癌患者进行雌激素替代治疗提供理论依据。

材料和方法

　　一、 卵巢癌细胞株的培养与17-β E₂的配制

　　CAOV3和 OVCAR3细胞，由美国Sloan Katherine 癌瘤研究所提供，以Gibco公司研制的无菌粉剂L-15加水配成10g/L，并分别加入胰岛素(终浓度为24 U/L)、 氢化可的松(终浓度为100μg/L)和庆大霉素(终浓度为100U/ml)；同样配制 RPMI-1604 (浓度为10g/L)，并分别加入青霉素(终浓度为100IU/ml)、 链霉素(终浓度为 100 μg/ml)；常规方法复苏冻存CAOV3和OVCAR3细胞，接种于含15%的热灭活的小牛血清培养液的瓶中，置于37℃含 5%二氧化碳饱和湿度培养箱内，用0.25%的胰酶消化传代。将溶于乙醇的17-β E₂用氮气吹挥浓缩后，加入含15%小牛血清的L-15 (或RPMI-1640) 培养液中，制成10nmol/L工作液。使用时,将工作液用培养液分别稀释为5.00、1.00、0.50和0.25 nmol/L即可(稀释后培养液中的乙醇浓度＜0.8%)。

　　二、17-β E₂与卵巢癌细胞株培养

　　1.卵巢癌细胞株生长抑制率：取生长良好的CAOV3和OVCAR3细胞（细胞浓度为1×10⁵个）铺40孔板，过夜贴壁。然后分别加入纯培养液及0.25、0.50、1.00和5.00 nmol/L的17-β E₂培养液作为对照组和实验组，每组4孔，3d后换液，6d时用MTT比色法检测不同板孔的吸光度(A)值，计算不同浓度17-β E₂对细胞生长的抑制率［抑制率=(对照组A均值-实验组A均值)/对照组A均值］。

　　2.卵巢癌细胞株生长周期：取生长良好的细胞株CAOV3和OVCAR3（细胞浓度为1×10⁵个）铺6孔板，过夜贴壁。然后分别加入纯培养液和0.50、5.00 nmol/L 17-βE₂培养液作为对照组和实验组，每组2孔，3d后换液，第6天时检测每组板孔内细胞的生长周期。测量时将贴壁细胞用0.25%胰酶消化1 min，以1 500r/ min 离心10 min,将细胞沉淀用磷酸缓冲液（PBS）冲洗后, 70%的冷乙醇固定3～5h。之后，再以1 500r/ min 离心10 min。沉淀物用PBS冲洗后，以PBS使之悬浮，浓度为1×10⁶个细胞/ml左右，用350目网过滤。于37℃下，取1ml悬浮液用RNA酶消化(RNA酶的终浓度为50 μl/ml)0.5 h。加入碘化丙锭（PI）(终浓度为50μl/ml)，于4℃，避光1 h，采用流式细胞仪进行细胞周期分析。

　　3.卵巢癌细胞株雌激素受体测定：细胞的加药处理同上。受体测定时用0.25%胰酶消化贴壁的细胞，将细胞悬浮液滴于用多聚赖氨酸处理过的载玻片上，用无水乙醇固定后，采用常规免疫组织化学法测定细胞株雌激素受体。

　　三、统计学处理

　　本研究采用SAS统计软件，进行方差分析。

结果

　　一、17-β E₂对卵巢癌细胞株生长的作用

　　1.17-β E₂对CAOV3细胞的影响：本研究结果表明，17-β E₂浓度为0.25～5.00 nmol/L时，对CAOV3细胞有抑制作用, 抑制率为7.7%～36.0%, 并呈现明显的剂量依赖关系，见表1。

表1　17-β E₂对CAOV3细胞的抑制率

　　注： 括号内的数字为每组标本编号(下同)　　2.17-β E₂对OVCAR3细胞的影响:与CAOV3相似，17-β E₂浓度为0.25～5.00 nmol/L时，对OVCAR3细胞有抑制作用, 抑制率为6.3%～18.2%，呈现明显的剂量依赖关系,见表2。

表2　17-β E₂对OVCAR3细胞的抑制率

　　3.17-β E₂对CAOV3和OVCAR3细胞作用的比较：分析不同浓度的17-β E₂对CAOV3和OVCAR3细胞的抑制率，结果表明，17-β E₂对CAOV3和OVCAR3细胞生长的抑制作用比较，差异有显著性（F=9.04，P=0.047），见图1。

图1　不同浓度17-β E₂对CAOV3和OVCAR3细胞的抑制率

　　二、17-β E₂对卵巢癌细胞株生长周期的影响

　　1. 17-β E₂对CAOV3细胞生长周期的影响：本研究结果表明，0.50～5.00 nmol/L浓度的17-β E₂可以明显改变CAOV3细胞的生长周期，使G₀及G₁期的细胞由55.0％减少为19.0％～30.0％，S期的细胞由30.0％增加到52.0％，G₂及M期的细胞由14％增加到17.0％～28.0％，并呈现明显的剂量依赖关系。

　　2. 17-β E₂对OVCAR3细胞生长周期的影响：与CAOV3相似，0.50～5.00 nmol/L浓度的17-β E₂可明显改变OVCAR3细胞的生长周期，使G₂及M期的细胞由37.0％减少为22.0％～30.0％，S期的细胞由31.0％增加到38.0％～51.0％，并呈现明显的剂量依赖关系。对G₀及G₁期的OVCAR3细胞没有明显的影响，加入17-β E₂前为32.0％，加入17-β E₂后为29.0％～31.0％。

　　3.加入17-β E₂前后癌细胞株雌激素受体的表达：CAOV3和OVCAR3细胞均为雌激素受体阳性细胞株。加入17-β E₂前后这两株细胞雌激素受体的表达没有明显变化。

讨论

　　一、雌激素对卵巢癌细胞株体外生长的影响

　　卵巢癌患者术后采用雌激素替代治疗的安全性问题，一直存在多种观点，研究结果很不一致。Runge等^［1］、Wimalasena等^［2］和 Yano等^［3］报道，雌激素可抑制卵巢癌细胞的生长；Nash等^［4］、Langdon等^［5］和Eeles等^［6］则报道，雌激素对卵巢癌细胞的生长没有影响；而Geisinger等^［7］和Rodriguez等^［8］却认为，雌激素可刺激卵巢癌细胞株的生长。本研究采用MTT方法的结果显示，0.25～5.00 nmol/L浓度的雌激素对CAOV3和OVCAR3细胞体外的生长没有明显的刺激作用，相反有轻度抑制作用，抑制率为6.3％～36.0%。这一点与Runge等^［1］的研究结果相吻合。同时本研究发现，雌激素对CAOV3和OVCAR3细胞生长的抑制强度不同，对CAOV3细胞的抑制率为7.7％～36.0%，对OVCAR3细胞的抑制率为6.3％～18.2%，两者比较，差异有显著性（P=0.047）。尤其在高浓度时则更为明显。我们认为，这些研究结果的不同，可能是由于不同的卵巢癌细胞株对雌激素的反应不同，也可能是不同浓度的雌激素对细胞株的作用不同。

　　二、雌激素对卵巢癌细胞株细胞周期的影响

　　本研究采用流式细胞术观察到，雌激素可影响卵巢癌细胞株的生长周期。细胞周期的不同，对雌激素具有不同的敏感性，在CAOV3细胞中，雌激素可明显地减少G₀及G₁期的细胞，使S期和G₂及M期的细胞增多；而在OVCAR3细胞中， 使G₂及M期的细胞明显减少，使S期和G₀及G₁期的细胞增加。有关机理尚待进一步研究。

　　三、外加雌激素与卵巢癌细胞株雌激素受体表达

　　国外有关研究提出，雌激素受体阳性的细胞株较阴性细胞株对雌激素更为敏感^［5］。我们采用免疫组织化学的方法显示，CAOV3和OVCAR3细胞的雌激素受体均为阳性，在加入雌激素前后受体表达没有明显变化。因此推测，雌激素对CAOV3和OVCAR3细胞生长的调节，可能是通过细胞核内的雌激素受体完成的；外加雌激素对细胞雌激素受体的表达没有明显影响。但要证实这一结论，尚需进行雌激素受体阴性的对照等研究。

参考文献

　　1，Runge HM, Teufel G, Geyer H, et al. In vitro responsiveness of ovarian epithelial carcinomas to endocrine therapy. Cancer Chemother Pharmacol, 1986， 16: 58-63.

　　2，Wimalasena J, Dostal R, Meehan D. Gonadotropins, estradial, and growth factors regulate epithelial ovarian cancer cell growth. Gynecol Oncol, 1992, 46: 345-350.

　　3，Yano J, Pinski J, Radulovic S, et al. Inhibition of human epithelial ovarian cancer cell growth in vitro by agonistic and antagonistic analogues of luteinizing hormone-releasing hormone. Proc Natl Acad Sci USA, 1994， 91: 1701-1705.

　　4，Nash JD, Ozols RF, Smyth JF, et al. Estrogen and anti-estrogen effects on the growth of human epithelial ovarian cancer in vitro. Obstet Gynecol, 1989, 73: 1009-1016.

　　5，Langdon SP, Hawkes MM, Lawrie SS, et al. Oestrogen receptor expression and the effects of oestrogen and tamoxifen on the growth of human ovarian carcinoma cell lines. Br J Cancer, 1990, 62: 213- 216.

　　6，Eeles RA, Tan S, Wiltshaw E, et al. Hormone replacement therapy and survival after surgery for ovarian cancer. BMJ, 1991, 302: 259-262.

　　7，Geisinger KR, Berens ME, Duckett Y, et al. The effects of estrogen, progesterone, and tamoxifen alone and in combination with cytotoxic agents against human ovarian carcinoma in vitro. Cancer, 1990, 65: 1055-1056.

　　8，Rodriguez C, Calle EE, Coates RJ, et al. Estrogen replacement therapy and fatal ovarian cancer. Am J Epidemiol, 1995, 141: 828-835.

(收稿日期：1999-04-07)