bcl-Xs基因转移联合顺氯氨铂对卵巢癌细胞生长作用的研究

中华妇产科杂志 2000年第2期第35卷 论著

作者：王和　Baker VV

单位：王和（610041 成都，华西医科大学附属第二医院妇产科）；Baker VV（美国密西根大学肿瘤中心妇产科）

关键词：卵巢肿瘤；原癌基因；顺氯

　　 摘　要：目的　采用以复制缺陷型腺病毒为载体的bcl-Xs基因（Adv-bcl-Xs）对卵巢癌细胞进行基因转移，同时使用顺氯氨铂，观察其对卵巢癌细胞生长的抑制作用。方法　用不同浓度的Adv-bcl-Xs感染卵巢癌细胞株NuTu-19，同时使用顺氯氨铂。3 d后，用四甲基偶氮唑蓝比色法检测存活细胞，并用流式细胞仪计数细胞周期百分比。结果　Adv-bcl-Xs对卵巢癌细胞生长的抑制作用随病毒浓度的增加而增大，至浓度为500 pfu/细胞以上时，其细胞生存百分比低于4.5%；顺氯氨铂对卵巢癌细胞生长的抑制作用也随药物浓度的增加而增加，至药物浓度为5 μg/ml以上时，其细胞生存百分比为0.0%；Adv-bcl-Xs与顺氯氨铂联合使用时对卵巢癌细胞的生长抑制率比两者单独使用时的细胞生长抑制率之和更高，其单独使用时的细胞生长抑制率之和的40%的生存曲线回归方程(Y=0.080 23-0.004 7X)与两者联合使用时细胞生长抑制率40%的生存曲线回归方程(Y=0.056 95-0.004 7X)比较，差异有极显著性(P＜0.01)。结论　Adv-bcl-Xs与顺氯氨铂联合使用对抑制卵巢癌细胞生长存在协同效应。

　　Synergistic Efficacy of Adenovirus-mediated bcl-Xs Gene Therapy and Cisplatin in Ovarian Cancer Cell

WANG He　BAKER

　　（Department of Obstetrics and Gynecology, Second University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu　610041, China）

　　 Abstract：Objective　To observe the presence of synergistic efficacy between adenovirus-mediated bcl-Xs (Adv-bcl-Xs) gene therapy and cisplatin (CDDP) in ovarian cancer cell. Methods　NuTu-19 cells were infected by different titers of Adv-bcl-Xs and treated with CDDP in the meantime. Percentage of cell proliferation was measured by methyl thiazolyl tetrazolium and cell cycles were measured by flow cytometry 3 days later. Graphical representations of the statistical analyses for their interaction in tumor cells. Results　The statistical results and Graphical representations of the statistical modeling showed that the synergistic antiproliferative activity was present (P＜0.01). Conclusion　There was synergistic efficacy between Adv-bcl-Xs gene and CDDP for the inhibition of ovarian cancer cell.Key words：Ovarian neoplasms；　Proto-oncogenes；　Cisplatin▲

　　卵巢癌是女性生殖器官最常见的三大恶性肿瘤之一，死亡率占女性生殖器官恶性肿瘤第1位。近年来，尽管临床上卵巢癌的诊断治疗水平有所提高，但5年生存率仍无明显改善。本研究为探讨提高卵巢癌疗效的可能性，拟对卵巢癌细胞转入以复制缺陷型腺病毒（Adv）为载体的bcl-Xs基因（Adv-bcl-Xs），同时使用顺氯氨铂，观察Adv-bcl-Xs联合顺氯氨铂对卵巢癌细胞生长的抑制作用。现报道如下。

　　材料和方法

　　一、材料

　　1. 卵巢癌细胞株：来源于大鼠费希尔（Fischer） 344 的卵巢上皮性癌细胞系NuTu-19，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基在5％二氧化碳培养箱中培养。

　　2.Adv和Adv-bcl-Xs：由美国密西根大学肿瘤中心Clarke博士实验室提供^［1］。

　　3. 顺氯氨铂：由美国A Bristol-Myers Squibb 公司赠送。

　　4. 四甲基偶氮唑蓝（MTT）以及检测细胞周期的相关试剂：（1）MTT染液（5 mg/ml）：将50 mg MTT溶于10 ml无菌磷酸盐缓冲溶液（PBS）中，-20℃保存；（2）MTT溶解液：将50 ml双蒸水加入50 ml N,N-二甲基甲酰胺中，再加入20 g 十二烷基硫酸钠（SDS），搅拌器搅拌1 h后常温保存；（3）检测细胞周期的溶解液：将碘化吡啶 5 mg和RNA酶1-A 100 mg溶解在100 ml 0.1%的柠檬酸钠、0.01%的诺乃清洁剂P-40（nonidet P-40）溶液中，避光保存。以上试剂均为美国Sigma 公司产品。

　　5. 仪器：分光光度计为芬兰Labsystems Multi- skan公司产品，MS 352型；流式细胞仪为美国Coulter公司产品， ESP型。

　　二、方法

　　1. 细胞抑制实验：将NuTu-19细胞放置于96孔板内，每孔2 000个细胞。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养至次日，分别加入下列试剂进行细胞抑制实验：（1）Adv和Adv-bcl-Xs：次日换用无胎牛血清的RPMI-1640培养基，以不同浓度(即0、1、50、100、500、1 000、5 000，单位为pfu/细胞)的Adv和Adv-bcl-Xs感染NuTu-19细胞，每一浓度均采用双孔。孵育4 h后换用5％胎牛血清的RPMI-1640培养基继续培养至第3天，再换上10％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养。直至病毒感染72 h后，每孔加25 μl MTT染液染色，放回培养箱孵育4 h；每孔再加100 μl MTT溶解液，37℃避光孵育至次日晨。（2）顺氯氨铂：次日换用含有浓度为0.00、0.08、0.16、0.31、0.63、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 μg/ml顺氯氨铂的10%胎牛血清RPMI-1640培养基，每一浓度均采用双孔。继续培养72 h，然后作MTT染色。（3） Adv-bcl-Xs和顺氯氨铂：次日换用无胎牛血清的RPMI-1640培养基，以浓度为0、25、50、75、100、125、150、175、200 pfu/细胞的Adv-bcl-Xs感染细胞，每一病毒浓度为24孔，每两孔中再分别加入终浓度为0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和0.9 μg/ml的顺氯氨铂。孵育4 h后换用带有同样药物浓度的5％胎牛血清RPMI-1640培养基培养至第3天，再换上同样药物浓度的10％胎牛血清RPMI-1640培养基培养，直到腺病毒感染72 h后，进行MTT染色。用分光光度计在波长600 nm下测定其吸光度（A）值，取双孔的平均值进行计算。以未加病毒感染的培养孔细胞的A值为细胞100%生存的标准值，以未加细胞、但和实验组一样同时加有各种试剂的培养孔的A值为细胞0%生存的标准值，以此计算细胞生存百分比。

　　2. 细胞周期测定：将NuTu-19细胞放置于12孔板内，每孔16 000个细胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养。次日换用无胎牛血清培养基，分别用0.0、0.5、1.0、2.0和4.0 pfu/细胞的Adv-bcl-Xs感染NuTu-19细胞，每一病毒浓度为8孔，每孔中再分别加入终浓度为0.0、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0 μg/ml的顺氯氨铂。孵育4 h后换用带有同样顺氯氨铂浓度的5％胎牛血清RPMI-1640培养基培养至第3天，再换上同样药物浓度的10％胎牛血清RPMI-1640培养，至Adv-bcl-Xs感染72 h后，取胰酶消化后的贴壁细胞，在离心管中清洗后，加入检测细胞周期的溶解液，打匀，室温下30 min后置入流式细胞仪中计数各实验孔细胞周期。

　　三、统计学处理

　　曲线拟合及统计学比较分析采用《中国医学百科全书·医学统计学》2.1版统计软件进行处理。图形采用美国Statsoft公司的Statistica for Windows 5.0 A版制作。

　　结果

　　一、Adv和Adv-bcl-Xs对NuTu-19细胞的抑制作用比较

　　Adv和Adv-bcl-Xs感染NuTu-19细胞后对细胞有抑制作用，其作用后的细胞生存百分比见表1。不同浓度的Adv对NuTu-19细胞的生长抑制作用较小，3 d后其细胞生存百分比均＞80%；而Adv-bcl-Xs对NuTu-19细胞作用后的细胞生存百分比随病毒浓度的增加而迅速下降，当病毒浓度在500 pfu/细胞以上时，其细胞生存百分比低于4.5%，两者比较，差异有显著性（P＜0.05）。

表1　Adv和Adv-bcl-Xs作用于NuTu-19细胞后细胞

　　生存百分比（%）

　　^*与Adv比较，当病毒浓度≥500 pfu/细胞时， P＜0.05二、顺氯氨铂对NuTu-19细胞的抑制作用

　　顺氯氨铂对NuTu-19细胞有抑制作用。NuTu-19细胞生存百分比随顺氯氨铂浓度增加而下降。见表2。细胞生存百分比和顺氯氨铂浓度呈负相关（P＜0.01）。

表2　NuTu-19细胞在顺氯氨铂作用后的

　　细胞生存百分比（%）

　　三、 Adv-bcl-Xs和顺氯氨铂对NuTu-19细胞的协同作用

　　采用不同浓度的Adv-bcl-Xs和顺氯氨铂联合作用于NuTu-19后的细胞生长抑制曲线见图1。Adv-bcl-Xs和顺氯氨铂两者单独使用时细胞生长抑制率之和的40%的生存曲线回归方程为Y=0.080 23-0.004 7X，而Adv-bcl-Xs和顺氯氨铂联合使用时细胞生长抑制率40%的生存曲线回归方程为Y=0.056 95-0.004 7X，两者比较，差异有极显著性（P＜0.01）。

图1　不同浓度的Adv-bcl-Xs和顺氯氨铂作用

　　于NuTu-19细胞后的细胞生长抑制曲线

　　四、Adv-bcl-Xs和顺氯氨铂对细胞周期的影响

　　NuTu-19细胞在没有bcl-Xs或顺氯氨铂作用时，细胞周期以G₀、G₁期为主，占80%。当单独加入bcl-Xs或顺氯氨铂时，S期细胞随药物浓度的增加而增多，当顺氯氨铂和bcl-Xs联合使用时，S期细胞随着浓度的增加而增多，但当药物浓度增加到一定时(Adv-bcl-Xs浓度为1 pfu/细胞，顺氯氨铂浓度为0.8 μg/ml)，S期细胞减少。见表3。

表3　不同浓度顺氯氨铂和Adv-bcl-Xs作用于

　　NuTu-19细胞后S期细胞的百分比（%）

　　讨论一、bcl-Xs的生物学作用

　　bcl-2基因家族对细胞凋亡起着调节作用并能改变肿瘤对化学治疗(化疗)药物的敏感性^［2-5］。bcl-2家系中，bcl-X基因能产生两种形式的蛋白产物。其长型蛋白产物是bcl-Xl, 功能与bcl-2相似，是细胞凋亡抑制因子；短型蛋白产物bcl-Xs促进细胞的凋亡，表现出和bcl-2、bcl-Xl相反的功能^［6］。研究表明，当bcl-Xs基因转移入多种肿瘤细胞后，其在肿瘤细胞中的表达能诱导肿瘤细胞凋亡，并且bcl-Xs只对肿瘤细胞的生长有特异性抑制作用，而对正常细胞没有抑制作用^［1］。Adv是基因治疗中最常用的载体，由于它去掉了早期蛋白E1基因，故不会在细胞中繁殖，安全且细胞的感染率高^［7］。

　　本研究采用Adv作为bcl-Xs的载体（Adv-bcl-Xs），对NuTu-19细胞进行bcl-Xs基因转移，观察不同浓度的病毒感染NuTu-19细胞3 d后，细胞的生长受到抑制。随着Adv-bcl-Xs病毒浓度升高，NuTu-19细胞生存百分比下降，当病毒浓度在500 pfu/细胞以上时，NuTu-19细胞生存百分比低于4.5%。而未带bcl-Xs基因的Adv对NuTu-19细胞的生长抑制作用较小，3 d后细胞生存百分比均＞80％。由于Adv-bcl-Xs携有一个bcl-Xs基因，随着病毒浓度的增加，带入肿瘤细胞的bcl-Xs基因的剂量也增加，NuTu-19细胞生存百分比则随bcl-Xs基因剂量的增加而下降，表明bcl-Xs在肿瘤细胞中的基因剂量越高，其过表达越重，对NuTu-19细胞的生长抑制作用也就越强。而未带bcl-Xs基因的Adv对NuTu-19细胞的生长影响不大，且不随病毒浓度增大而发生变化。

　　二、顺氯氨铂对NuTu-19细胞生长的影响

　　顺氯氨铂是治疗卵巢癌常用的化疗药物。本研究中，随着顺氯氨铂浓度的增高，NuTu-19卵巢癌细胞生存百分比逐渐下降至0.0%。表明顺氯氨铂对NuTu-19细胞具有生长抑制作用。

　　三、Adv-bcl-Xs联合顺氯氨铂对NuTu-19细胞生长的影响

　　Nielsen等^［8］对多种肿瘤细胞用Adv介导，以能促进细胞凋亡的基因p53作基因转移，同时使用化疗药物，结果发现，联合使用后能够产生协同作用。Sumantran等^［7］报道，bcl-Xs基因不仅能诱导肿瘤细胞的凋亡，而且其过表达还能增加乳腺癌细胞株MCF-7对化疗药物的敏感性。本研究结果显示，在Adv-bcl-Xs和顺氯氨铂还处于相对较低浓度时，对NuTu-19细胞的生长已经表现出较强的抑制作用，形成协同效应。bcl-Xs在NuTu-19细胞中的过表达使低浓度的顺氯氨铂诱导细胞凋亡的作用更为敏感。Sumantran等^［7］的研究证实，bcl-Xs不仅能增强不同化疗药物对肿瘤细胞的抑制作用，而且也能提高源于不同组织的肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。

　　四、bcl-Xs联合顺氯氨铂的作用机理

　　本研究中，单独使用bcl-Xs或顺氯氨铂时，随药物浓度的增加而S期细胞百分比增高，表明bcl-Xs与顺氯氨铂对S期细胞作用相似。由于顺氯氨铂攻击DNA碱基的氮原子，抑制DNA合成，阻断细胞进入G₂期，使细胞停留在S期，从而影响细胞的增殖。虽然bcl-Xs对肿瘤细胞周期的影响与顺氯氨铂一致，但bcl-Xs和顺氯氨铂诱导肿瘤细胞凋亡的机理却有所不同。当bcl-Xs和顺氯氨铂联合使用浓度增加到一定时，S期细胞的百分比下降，提示两者联合使用时对肿瘤细胞的生长抑制有协同作用，可能与抑制细胞生长的多个环节有关。bcl-Xs和顺氯氨铂导致肿瘤细胞更加全面和大范围的抑制直至死亡的确切机理，有待进一步研究。

　　志谢　本研究得到美国密西根大学肿瘤中心Clarke博士的大力协助；本研究中统计学分析得到华西医科大学卫生统计学教研室刘关键老师的大力支持。特此一并志谢

　　基金项目：本研究受教育部留学基金管理委员会资助(基金编号：96361017)

　　参考文献：

　　［1］Clarke MF, Apel IF, Benedict MA,et al. A recombinant bcl-Xs adenovirus selectively induces apoptosis in cancer cells but not in normal bone marrow cells. Proc Natl Acad Sci, 1995, 92:11024-11028.

　　［2］Lowe SW, Ruley HE, Jacks T, et al. p53-dependent apoptosis modulates the cytotoxicity of anticancer agents. Cell, 1993, 74: 957-967.

　　［3］Chiou SK, Rao L, White E. bcl-2 blocks p53 dependent apoptosis. Mol Cell Biol, 1994, 14: 2556-2563.

　　［4］Dole M, Nunez G, Merchant A, et al. bcl-2 inhibits chemotherapy-induced apoptosis in neuroblastoma. Cancer Res，1994, 54:3253-3259.

　　［5］Kamesaki S, Kamesaki H, Jorgenson TJ, et al. bcl-2 protein inhibits etoposide-induced apoptosis through its effects on event subsequent to topoisomerase II-induced DNA strand breaks and their repair. Cancer Res， 1993, 53:4251-4256.

　　［6］Boise LH, Gonzalez-Garcia M, Postema CE, et al. bcl-X and bcl-2 related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death. Cell, 1993, 74:597-608.

　　［7］Sumantran VN, Ealovega MW, Nunez G, et al. Overexpression of bcl-Xs sensitives MCF-7 cells to chemotherapy-induced apoptosis. Cancer Res, 1995, 55:2507-2510.

　　［8］Nielsen LL, Lipari P, Dell J, et al. Adenovirus-mediated p53 gene therapy and paclitaxel have synergistic efficacy in models of human head and neck, ovarian, prostate and breast cancer. Clin Cancer Res, 1998, 53:835-846.

收稿日期：1999-07-22