单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因/羟甲基无环鸟苷系统对人卵巢癌裸鼠网膜移植瘤的作用

中华妇产科杂志 1999年第3期第0卷 论　著

作者：徐丛剑　张惜阴　金志军　丰有吉 许秀兰　姚明　曹斌融　周先荣　顾健人

单位：200011 上海医科大学妇产科医院(徐丛剑，张惜阴，丰有吉，曹斌融，周先荣)；第二军医大学长征医院妇产科(金志军)；上海市肿瘤研究所(许秀兰，姚明，顾健人)

关键词：卵巢肿瘤；基因治疗；疱疹病毒1型；人；胸苷激酶；疾病模型；动物

　　【摘要】　目的　观察单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因(HSV₁-tk)/羟甲基无环鸟苷(GCV)系统对人卵巢癌的体内治疗作用。方法　先将人卵巢癌细胞AO及携有HSV₁-tk基因的AO细胞（AO/HSV₁-tkc）注射于裸鼠皮下，形成肿瘤后再移植于裸鼠网膜，并以病毒生产细胞（VPC/HSV₁-tkc）的培养液对AO网膜移植瘤进行体内转染，然后以GCV对体外AO/HSV₁-tkc转移的肿瘤及经体内转染的AO肿瘤进行治疗。结果　HSV₁-tk/GCV基因治疗系统对AO裸鼠网膜移植瘤的抑制率为46.8%，而AO/HSV₁-tkc裸鼠网膜移植瘤经GCV治疗后，多数仅残留显微镜下可见的癌灶。　结论GCV在腹腔内对携有HSV₁-tk基因的肿瘤具有更为显著的杀伤效应;HSV₁-tk/GCV基因治疗系统在卵巢癌的治疗上可能具有良好的应用前景。

　　Effect of the Herpes Simplex Virus I-thymidine Kinase Gene-ganciclovir System on the Transplant of Human Ovarian Cancer on the Omentum of Nude Mice 　XU Congjian, ZHANG Xiyin, JIN Zhijun, et al. Gynecology and Obstetrics Hospital of Shanghai Medical University, Shanghai, 200011

　　【Abstract】　Objective　To investigate the therapeutic effect of the herpes simplex virus I-thymidine kinase gene (HSV₁-tk)/ ganciclovir(GCV) system on human ovarian cancer.Methods　The nude mice tumors were formed by injection of human ovarian cancer cell line AO and AO/HSV₁-tkc (AO cells carried with HSV₁-tk gene which was constructed in China) subcutaneously, and then were transplanted to the omentum of nude mice. The filter-passing culture fluid of VPC/HSV₁-tkc was injected daily into the peritoneum of the nude mice in the group of in vivo. Finally, all of the three groups of nude mice (control, in vivo, ex vivo) accepted the treatment of GCV.Results　The inhibitory rate of the RV/HSV₁-tkc/GCV to AO tumors were 46.8%, and, only could the residual microscopic tumors be seen in most of the nude mice omentum transplanted with AO/HSV₁-tkc tumor after GCV treatment.Conclusions　GCV could more effectively inhibit the growth of the human ovarian tumors carried with HSV₁-tk gene which was transplanted onto the nude mice omentum than which transplanted subcutaneously; The application of the HSV₁-tk/GCV system would be very promising in the gene therapy of ovarian cancer.

　　【Key words】　Ovarian neoplasms 　　 Gene therapy　　Herpesvirusl, human　　Thymidine kinase 　　 Disease models, animal

　　体外研究结果表明，Ⅰ型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因(HSV₁-tk)可通过逆转录病毒(RV)介导，导入人卵巢上皮性癌癌细胞，并可在细胞内获得高效表达，从而使癌细胞被羟甲基无环鸟苷(GCV)有效地杀伤^［1］。皮下移植瘤治疗研究提示，GCV在裸鼠体内代谢后仍可高效地杀伤携有HSV₁-tk的人卵巢癌细胞，从而抑制肿瘤生长^［2］。为进一步探讨卵巢癌的临床基因治疗，本研究分别通过先在体外导入由HSV₁中国株中克隆获得的HSV₁-tk（HSV₁-tkc），再移植入体内进行治疗，及直接在体内对靶细胞进行基因转移和治疗两种途径，观察HSV₁-tk/GCV基因治疗系统对人卵巢癌裸鼠网膜移植瘤的体内治疗作用。

　　材料与方法

　　一、研究材料

　　1.细胞的来源及培养：人卵巢上皮性癌癌细胞系AO来自中国科学院上海细胞库；病毒生产细胞（VPC/HSV₁-tkc，可产生含有HSV₁-tkc基因的假型逆转录病毒颗粒）由上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室提供。以上两种细胞均在37℃、5％ CO₂条件下培养。于体内转染前3天，在25 cm²培养瓶中接种VPC/HSV₁-tkc细胞，每瓶细胞数1×10⁶，次日细胞贴壁后更换新鲜培养液，置32℃、5％ CO₂环境中培养。AO/HSV₁-tkc细胞是以VPC/HSV₁-tkc细胞培养液体外转染AO细胞，并经G418筛选后获得^［1］，在37℃、5％CO₂条件下培养。

　　2.裸鼠：雌性BALB/c裸小鼠，均为4～6周龄，由上海市肿瘤研究所动物室提供并饲养。

　　二、方法

　　1.网膜移植^［2］：(1)供体瘤块制备：先将体外培养的AO，AO/HSV₁-tkc细胞接种于裸鼠背部皮下，6周后处死裸鼠取出瘤体，切成3 mm×3 mm×3 mm大小的瘤块，AO16块，AO/HSV₁-tkc11块。再从中分别剔去较大和较小的瘤块各3块，剩余瘤块(AO10块，AO/HSV₁-tkc5块)浸于生理盐水中备用。所提取的瘤块称重以估计瘤块重量(AO平均58 mg,AO/HSV₁-tkc平均63 mg)。(2)受体裸鼠：共15只，于腹腔内注射戊巴比妥钠45 mg/kg,麻醉平稳后剖开腹壁，以7-0缝线将AO瘤块分别缝扎于10只裸鼠的脾区网膜，并作半包埋，关闭腹腔后随机分为两组，一组为体内转染组，另一组为对照组，每组为5只裸鼠。5块AO/HSV₁-tkc瘤块同上方法移植于另5只裸鼠脾区网膜，作为体外转染组。

　　2.RV体内转染：上述AO/HSV₁-tkc培养液吸出后，以0.22 μm微孔滤膜过滤后，注入体内转染组裸鼠(移植术后48小时)腹腔内，每只裸鼠每日1ml，共14日。同时于另两组裸鼠腹腔内注射普通培养液。

　　3.GCV治疗：RV体内转染后，体内、体外转染组分别腹腔注射GCV(美国Syntex公司惠赠)，每日每千克体重100 mg，每周5日为一疗程，共2周。同时于对照组裸鼠腹腔内注射等体积生理盐水。治疗后2日处死全部裸鼠，取瘤块称重，并进行病理组织学检查及电镜检查。

　　结　果

　　一、3组裸鼠肿瘤重量

　　3组裸鼠肿瘤重量见表1。结果显示，如在体外先导入HSV₁-tkc基因，则GCV对这些HSV₁-tkc基因的AO细胞所形成的裸鼠网膜瘤的抑瘤率可高达92.3％；而以携有HSV₁-tkc的AO细胞所形成的裸鼠网膜瘤经HSV₁-tkc基因体内转染后，再以GCV治疗，其抑瘤率也可达到46.8％。

　　　　表1　3组裸鼠网膜移植瘤重量比较

组　别	肿瘤重量(g,±s)	抑瘤率(w/w,%)
对照组	2.16±1.49
体内转染组	1.15±0.45	46.8
体外转染组	0.17±0.08*	92.3

　　^*与对照组比较，P＜0.05(t'＝3.015)

　　二、裸鼠尸检结果

　　3组肿瘤大多仅累及网膜及胰腺，仅对照组中1只裸鼠肿瘤侵及脾脏及胰腺，所有肿瘤均呈单一生长，易于分离切除。体内转染组中有1只裸鼠治疗后第2日夜间因严重腹腔感染死亡(死亡时间距处死其他裸鼠少于10小时)，而体外转染组仅1只裸鼠目检可见网膜上有肿瘤结节。

　　三、病理组织学检查结果

　　对照组肿瘤与皮下移植瘤比较，组织学检查无明显差异，电镜检查提示，对照组与体外培养的AO细胞形态相似；体内转染组大部分区域与体外转染组相似；体外转染组5只裸鼠镜下均可见癌巢，但多数残存细胞肥大，核淡染，核内及胞浆内可见大量空泡，呈变性坏死表现。也可见核固缩、碎裂的细胞，并可见大量间质细胞浸润。

　　讨　论

　　一、关于体内转染与体外转染

　　本研究结果显示，体外转染组中，GCV对AO/HSV₁-tkc网膜移植瘤的抑瘤率为92.3％(如除去网膜本身的重量，其抑瘤率会更高，本研究中有4只裸鼠仅见镜下癌巢)，显著高于既往研究所显示的GCV对AO/HSV₁-tkc皮下移植瘤的抑瘤率(86.8％)^［3］。这可能是由于GCV直接接触肿瘤细胞，且肿瘤细胞死亡后，在网膜中更容易被清除所致的结果。由此证实，将HSV₁-tkc高效并选择性地导入卵巢癌细胞，则GCV对其体内杀伤效应是非常显著的。

　　然而，在实际的以体内肿瘤细胞为靶细胞的临床治疗中，体外转染的方法是难以得到应用的。因此，只有应用体内转染的方法，才能真正观察HSV₁-tk/GCV基因治疗系统对卵巢癌的综合治疗作用。

　　既往曾有将病毒产生的细胞注射到大鼠脑肿瘤部位，再给予GCV治疗，结果导致肿瘤完全消失^［4］的报道。但卵巢癌存在于腹腔，不存在血脑屏障的分隔，且由于发现肿瘤时大多已发生广泛种植转移，因而肿瘤分布较为弥散。根据这一特点，本研究以VPC/HSV₁-tkc培养液反复进行腹腔内注射，以使RV在体内多次感染肿瘤细胞，再给予GCV进行治疗。结果表明，以这一方法治疗人卵巢癌裸鼠网膜移植瘤，其抑瘤率为46.8％，说明这一方法有一定疗效。Tong等^［5］曾将培养的卵巢癌细胞注入裸鼠腹腔后，再注射携有由Rous肉瘤病毒驱动的HSV₁-tk腺病毒病毒液及GCV，也获得了较好的治疗结果^［5］。但他们在先期的实验中观察到，裸鼠腹腔注射卵巢癌细胞其生成瘤及生存期的一致性较差。而本研究所应用的裸鼠网膜移植瘤模型，则具有肿瘤生长一致性好、便于计量分析的特点。但在本研究中，肿瘤以瘤块形式存在，不利于RV与肿瘤细胞的密切接触，这就影响了目的基因(HSV₁-tkc)的转导。在临床治疗中，如在卵巢肿瘤细胞减灭术后再应用这一治疗方法，则手术残留的少量肿瘤细胞可与RV充分接触，可能将进一步提高RV的感染率及对肿瘤的治疗作用。

　　二、关于逆转录病毒载体

　　逆转录病毒载体的特点，是能将目的基因携入处于分裂增殖状态的细胞。肿瘤细胞与正常细胞相比，其增殖较为活跃。因此，可以认为，逆转录病毒载体具有一定的靶向性。但在腹腔内尚有其他一些细胞如上皮细胞等增殖也较活跃，也可能被应用RV作为载体的基因治疗系统所损伤。本研究中1只裸鼠严重感染死亡，是否与此有关，有待进一步研究。

　　总之，HSV₁-tk/GCV基因治疗系统在卵巢癌的治疗方面将具有良好的应用前景，但其具体应用方法，尚需进一步研究。

　　本研究受国家自然科学基金资助(基金编号：39800144)

　　参考文献

　　1　徐丛剑，许秀兰，张惜阴，等.逆转录病毒介导Ⅰ型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因转导卵巢癌细胞的研究.中华妇产科杂志，1996， 31: 664- 666.

　　2　徐丛剑，张惜阴，金志军，等.羟甲基无环鸟苷对携有单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用.中华妇产科杂志，1997，12：709～711.

　　3　徐丛剑，金志军，丰有吉，等.人卵巢癌裸鼠腹腔及网膜常位移植.现代妇产科进展，1997, 6: 111-113.

　　4　Culver KW, Ram Z, Wallbridge S,et al. In vivo gene transfer with retroviral vector-producer cells for treatment of experimental brain tumors. Science, 1992, 256: 1550-1552.

　　5　Tong XW, Block A, Chen SH, et al. In vivo gene therapy of ovarian cancer by adenovirus－mediated thymidine kinase gene transduction and ganciclovir administration. Gynecol Oncol, 1996, 61: 175-179.

(收稿：1998-03-26　　修回：1998-12-28)