卵巢癌组织中乳腺癌易感基因突变及其临床意义

中华妇产科杂志 1998年第11期第0卷 论　　著

作者：史惠蓉　尤宗兵　郭燕燕

单位：100034 北京医科大学第一医院妇产科［史惠蓉 (现在河南医科大学第一附属医院妇产科)，尤宗兵，郭燕燕］

关键词：卵巢肿瘤；遗传性；基因；BRCA1；突变

　　【摘要】 　目的　检测卵巢癌组织中乳腺癌易感基因(BRCA1)突变，探讨其与遗传性卵巢癌的关系。方法　应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)及非同位素银染技术，检测4例遗传性卵巢癌及31例散发性卵巢癌BRCA1基因突变。结果　在3例遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征(HBOC)患者中2例BRCA1基因突变，分别位于外显子2和21。31例散发性卵巢癌和1例遗传性位点特异性卵巢癌中未检出BRCA1基因突变。结论　BRCA1基因突变可能与HBOC的发病关系密切。BRCA1基因突变的检测有助于诊断HBOC。

　　Mutation of Breast Cancer Susceptibility Gene in Ovarian Cancer and Its Clinical Significance　Shi Huirong^*, You Zongbing, Guo Yanyan.　^*The First Affiliated Hospital of Henan Medical University, Zhengzhou 450052 450052

　　【Abstract】　Objective　To detect breast cancer susceptibility gene (BRCA1) mutation in ovarian cancer and to look for correlations between BRCA1 mutation and hereditary ovrian cancer.Methods　Mutation of BRCA1 gene in 4 patients with hereditary ovarian cancer and 31 patients with sporadic ovarian cancer were screened by polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism analysis with non-isotopic silver staining method.Results　2 mutations of BRCA1 gene were found in 2 of 3 patients belonged to hereditary breast- ovarian cancer syndrom ( HBOC ) which were located in exon 2 and 21 respectively. No mutation was found in 31 cases of sporadic ovarian cancer and 1 case of hereditary site-specific ovarian cancer.Conclusion　BRCA1 mutation was probably closely related to hereditary breast-ovarian cancer syndrome . Detection of BRCA1 gene mutation was helpful to diagnose HBOC families.

　　【Key words】　Ovarian neoplasms　　Hereditary 　　Gene， BRCA1 　　Mutation

　　流行病学调查显示, 卵巢癌家族史是卵巢癌发病最重要的危险因素^［1］。 现已确定了几种遗传性卵巢癌综合征 (hereditary ovarian cancer syndrome, HOCS), 包括遗传性非息肉性结直肠癌, 遗传性位点特异性卵巢癌(HSSOC)和遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征(hereditary breast-ovarian cancer syndrom, HBOC)^［2］。其中HBOC与乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility gene, BRCA1)突变的关系在国外已有不少报道^［3～6］。本研究应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)及非同位素银染技术, 对我院1990年以来收治的4例遗传性卵巢癌和31散发性卵巢癌(sporadic ovarian cancer)患者的癌组织标本进行BRCA1基因突变筛查, 现将结果报道如下。

材料和方法

　　一、研究对象

　　35例原发性上皮性卵巢癌组织，取自1990年2月至1995年10月在我院手术切除并用液氮冻存的标本。由专人追踪调查患者的家系, 调查对象为患者本人及(或)直系亲属，调查内容为患者3代以内有血缘的亲属患肿瘤的情况。肿瘤诊断以病理学检查为准。家谱分析按照Lynch等^［2］的标准。35例中3例属于HBOC，组织学类型均为浆液性囊腺癌；1例属于HSSOC，组织学类型为卵巢子宫内膜样癌；31例为散发性卵巢癌，组织学类型分别为浆液性囊腺癌12例, 粘液性囊腺癌4例，子宫内膜样癌8例，混合性上皮癌7例。

　　二、方法

　　1．DNA样品的制备：基因组DNA的提取采用常规的蛋白酶K消化、酚-氯仿抽提和乙醇沉淀法，TE缓冲液溶解后用紫外线分光光度计定量。

　　2．PCR扩增目的片段：BRCA1基因2～24外显子引物共28对，其中第11外显子引物7对，第6和第7外显子共用1对。引物序列和扩增片段长度由Skolnick 教授提供^［3］。全部引物由美国Genemed生物技术公司合成。PCR反应条件为95℃ 变性60秒, 53℃复性30秒(各引物复性温度, 范围在51～56℃之间), 72℃延伸60秒。 经30个周期循环后, 72℃延伸5分钟。取10 μl反应产物, 经1.5%含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。

　　3．应用SSCP检测基因突变：将PCR产物2 μl与变性液6 μl(95%去离子甲酰胺、20 mmol/L 乙二胺四乙酸、0.05%二甲苯蓝FF和溴酚蓝)混匀后，95℃变性10分钟，立即放入冰水中冷却3分钟，取6 μl 加样， 用5%或8%中性聚丙烯酰胺凝胶，400V恒压，15℃恒温电泳2～3小时。用0.1%硝酸银染胶，显带后立即摄像^［7］。对扩增片段长度在250～550 bp的外显子2～10、12～24，以及外显子11的b、e、f 3个片段直接进行SSCP；对扩增片段长度＞550 bp的外显子11的a、c、d、g4个片段(616～769 bp)，先用适当的限制性内切酶进行酶切,再用酶切产物行PCR-RE-SSCP。所用的限制性内切酶EcoR1、Dde1、Hph1购自美国Promega和MBI Fermentas公司。

结果

　　35例患者中，在31例散发性卵巢癌和1例HSSOC组织中，未发现异常DNA迁移带型。3例HBOC卵巢癌组织中，检测出2例有异常迁移带型，其中1例第2外显子有突变， 该患者68岁, 为右侧卵巢低分化浆液性囊腺癌, FIGO分期为IV期(胸水中查见癌细胞)。术后曾采用CAP(环磷酰胺、阿霉素、顺铂)方案化疗3个疗程，于术后4个月死亡。患者的一、二级有血缘亲属中，有3例患乳腺癌和1例患卵巢癌。患者两个女儿均患双侧乳腺癌，发病年龄分别为22岁和25岁，手术后仍健在。 另1例患者为第11外显子有突变，患者43岁，为左侧卵巢中分化浆液性囊腺癌, FIGO分期为Ⅲ期, 术后分别采用CAP方案、CP(环磷酰胺、顺铂)方案化疗共10个疗程，现已术后35个月仍存活。患者的母亲和1个姑母患卵巢癌, 另1个姑母和祖母患乳腺癌, 父亲和外祖父分别患肝癌和肺癌。

讨论

　　一、BRCA1基因的结构与性质

　　BRCA1基因于1990年首次由Hall等^［8］通过遗传连锁分析而识别。Narod等^［9］于1991年将BRCA1基因定位于染色体17q12～23, 确认该基因是乳腺癌-卵巢癌易感基因。1994年Skolnick等完成了BRCA1基因的定位克隆^［3］, 使BRCA1基因的研究取得了突破性进展。BRCA1基因位于染色体17q21D17S1321～D17S1325之间, 由22个编码外显子(外显子2～23)和2个非编码外显子(外显子1和24)构成,占据100 kb的基因组DNA, 转录产物7.8 kb,编码蛋白含1 863个氨基酸。 其氨基末端含有1个锌指微区，提示BRCA1基因可以调节基因的表达。现已认为，BRCA1基因是一个肿瘤抑制基因^{［4，10～12］}，编码抑癌蛋白, 对肿瘤生长产生负性调节。BRCA1基因的失活方式, 符合Knudson提出的抑癌基因失活的“二次打击”模式^［13］。肿瘤易感性以常染色体显性遗传方式获得, 即配子水平1个等位基因突变导致个体易患肿瘤,但在体细胞中，此缺陷的等位基因则处于隐性状态，只有当另1个野生型等位基因丢失或失活时,才会发生恶性转变。

　　二、BRCA1基因突变与卵巢癌的关系

　　现已知BRCA1基因突变是早发性乳腺癌及卵巢癌的易感因素，80%的HBOC家族中发现有该基因变异^［4］, 但在散发性乳腺癌及卵巢癌中，BRCA1基因突变则极少见^{［4，5，11］}。本研究在已确诊的3例HBOC家族患者中，发现有2例BRCA1基因分别在第2外显子和第21外显子发生突变。而在31例散发性卵巢癌组织和1例HSSOC中未发现BRCA1突变。说明BRCA1基因突变可能与HBOC关系密切，而对散发性卵巢癌影响很小，此结果与国外的报道相一致^{［4，5，11］}。

　　三、检测BRCA1基因突变的临床意义和方法

　　详细的家谱分析是诊断包括HOCS在内的遗传性疾病的基本手段, 但随着时代的发展， 家族不断趋于缩小，使得依靠家谱分析来诊断某种疾病的遗传倾向越来越困难。由于HBOC家族成员中BRCA1基因突变率高达80%, 而非HBOC家族的患者突变率甚低^{［4，5，11］}, 故对BRCA1基因突变的检测可帮助确定HBOC家族和家族中BRCA1基因突变携带者；并可对家族成员进行外周血淋巴细胞检测，进行遗传风险评估。据报道，BRCA1基因突变携带者在50岁时发生乳腺癌和卵巢癌的风险分别为73%和29%, 在70岁时分别为87%和44%, 患任何一种癌的终身风险则接近100%^［14］。同时，对家族中未发现患癌的BRCA1基因突变携带者进行预防性监测，以早期诊断，具有重要的临床意义。

　　SSCP是一种常用的检验基因结构改变的方法，当DNA片段长度在300 bp以内时，SSCP分析检测基因突变的准确性为90%～100%^［15］。由于BRCA1基因结构庞大，不少外显子DNA片段超过了300 bp，可使SSCP的敏感性降低。本研究采用的PCR-RE-SSCP方法，可将较大的DNA片段酶切为较小的片段，在一定程度上增加了检测的敏感性。该实验方法简单，重复性好，不需使用同位素，准确性较高，可作为筛查BRCA1基因突变的一种方法。另外，尚可采用蛋白质截断试验(protein truncation test), 简化对外显子11的筛查，并可建立BRCA1基因诊断试剂盒, 使BRCA1基因突变的检测更易于临床应用。

参考文献

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(收稿：1997-11-26　　修回：1998-07-05)