野生型P53和C-Ha-ras基因在顺铂诱导膀胱癌细胞凋亡中的表达及意义

中华泌尿外科杂志 1998年第7期第19卷 论　　著

作者：张廷继　陈一戎　王志平　段国兰　刘国栋　徐晨阳　史庭恺

单位：730030　兰州医学院第二附属医院泌尿外科研究所

　　关键词： 膀胱肿瘤；癌；基因；凋亡

　　摘要　应用荧光原位杂交技术观察顺铂诱导膀胱癌细胞株BIU-87体外细胞凋亡过程中野生型P53和C-Ha-ras基因的表达，探讨抗癌药物诱导膀胱癌细胞凋亡过程中抗癌基因和癌基因的作用。结果显示：顺铂能够明显地诱导膀胱癌细胞凋亡，具有一定范围内的作用时间和药物浓度的依赖性。随凋亡细胞数上升，野生型P53表达增强，而C-Ha-ras基因表达下降，提示膀胱癌细胞凋亡可能是顺铂的杀瘤效应途径之一。P53和C-Ha-ras基因均参与了细胞凋亡的调控过程，野生型P53基因可能是通过下调C-Ha-ras基因的表达而发挥其抑制细胞增殖活性，促进凋亡的发生。

　　The expression of wild-type P53 and C-Ha-ras in bladder cancer cells with apoptosis induced by cisplatin (CDDP)　Zhang Tingji, Chen Yirong, Wang Zhiping, et al. Department of Urology, the Second Affiliated Hospital, Lanzhou Medical College, Lanzhou 730030

　　Abstract　The expression of P53 and C-Ha-ras of BIU-87 bladder cancer cell lines with apoptosis induced by CDDP was detected by means of fluorescence immuno in situ hybridization (FISH).An extensive apoptosis in BIU-87 cells treated by CDDP has occured, which was dependent on an apropriate concentration of the drug or treatment time. The positive expression rate of P53 has been significantly upregulated and C-Ha-ras was downregulated as apoptotic index increased. These results suggested enhanced expression of P53 or decreased expression of C-Ha-ras might be involved in apoptosis or inhibition of the proliferation of bladder cancer cells induced by CDDP.

　　Key words　Bladder neoplasms　　Carcinoma　　Genes　　Apoptosis

　　应用荧光原位杂交技术观察顺铂诱导膀胱癌细胞BIU-87体外细胞凋亡的过程中野生型P53和

　　C-Ha-ras基因的表达，以对抗癌药物诱导膀胱癌细胞凋亡过程中抗癌基因和癌基因的作用进行探

　　讨。

　　材料和方法

　　一、试剂

　　RPMI-1640为GIBCO公司产品。胎牛血清为华美公司产品。蛋白酶K为Sigma产品。顺铂为齐鲁制药厂产品。

　　二、细胞培养及处理

　　人膀胱癌细胞株BIU-87(北京医科大学泌尿外科研究所提供)以浓度8×103/孔接种细胞于24

　　孔培养板，用含15%胎牛血清RPMI-1640的全培养基在37℃、5%CO₂孵箱中培养。细胞生长期以

　　含浓度0～100μmol/L顺铂的培养液处理，分别处理12、24、48及72小时，用0.25%胰酶EDTA液

　　消化获得细胞悬液，分别作HE和吖啶橙(AO)染色。凋亡细胞特征为细胞核染色质萎缩浓集于核

　　膜下，构成环状结构，或呈月牙形，或核碎裂成块状，胞浆浓集外突形成凋亡小体。采用改良

　　Rasbrige方法^［1］，每片选5个视野，随机计数100个细胞核中凋亡改变细胞所占百分比，共计数1

　　000个细胞，计算凋亡指数(AI值)。本实验重复4次。

　　三、P53和C-Ha-ras基因探针标记

　　P53和C-Ha-ras基因探针(cDNA、XbaI、1.8kb)由北京医科大学血液病研究所提供。C-Ha-ras

　　基因探针(cDNA、EcoI、0.8kb)由北京市肿瘤研究所提供。均采用随机引物法核苷酸生物素标记

　　(随机引物试剂盒为Promage公司产品)。

　　四、原位杂交及杂交信号分析

　　应用荧光原位杂交技术(FISH法)，主要步骤是用上述细胞悬液涂片，于70℃烤片，经蛋白酶K消化，用4%多聚甲醛固定，经80℃变性和42℃杂交过夜，采用间接免疫荧光法检测。杂交信号分析参照文献［2］。

　　五、数据处理

　　检测不同浓度顺铂作用BIU-87细胞时P53-Wt和C-Ha-ras基因表达的数据分析，采用比较t检

　　验。顺铂作用时间与P53-Wt和C-Ha-ras基因表达关系的数据分析采用均数t检验。

　　结　　果

　　一、顺铂处理后BIU-87凋亡指数测定

　　顺铂处理BIU-87细胞相同时限后，AI值随药物浓度增加而呈上升趋势；药物浓度太低和过高都不能使AI值增加，与未加药物组之间无显著性差异(P＞0.05)。因此，AI值变化一定范围内具药物浓度信赖性，同时还受药物毒性作用影响(图1)。相同浓度顺铂处理BIU-87细胞，AI值变化与作用时间成正比，提示AI值变化也具有作用时间依赖性，作用时间延长则AI值递减(图2)。

　　二、P53-Wt和C-Ha-ras基因阳性表达特征

　　P53-Wt基因阳性表达是细胞核被PI染成棕红色，阳性信号呈黄绿色亮点；部分细胞呈现一核多点表达，最多者可达7个点。随机计算结果，多点表达细胞(同一核两点以上表达的细胞)在实验组占阳性细胞数的28.3%，对照组仅7.3%。C-Ha-ras基因阳性表达是细胞核被PI染色呈棕红色，阳性信号呈黄绿色团块状或半月形亮区紧贴于核膜下，未见一核多处表达现象。

图1　顺铂浓度与凋亡指数关系

图2　顺铂作用时间与凋亡指数关系

　　三、P53-Wt基因和C-Ha-ras基因的表达率与AI值关系

　　原位杂交结果分析，顺铂处理细胞后随培养时间的延长，P53-Wt表达上升和C-Ha-ras基因的表达下降。不同浓度的顺铂作用细胞48小时显示实验组P53-Wt表达明显升高和C-Ha-ras基因的表达明显降低，P均＜0.05(附表)。P53-Wt基因表达的趋势与AI值变化相一致，二者呈正相关关系；C-Ha-ras基因表达随凋亡指数升高至下降趋势，二者呈负相关。

讨　　论

　　许多抗癌药物能通过干扰肿瘤细胞生长、代谢、增殖等过程最终触发肿瘤细胞程序化死亡

　　通路，导致细胞凋亡。药物诱导肿瘤细胞凋亡的机理可能涉及DNA损伤，基因表达等一系列形

　　态学和生化改变过程，已经发现P53、c-myc、bc1-2、APO-I、P34cdk2激酶等均参与这一过程。

　　有人认为凋亡是抗癌药物杀瘤机制中肿瘤细胞最主要的死亡方式，推测细胞通过G2期抑制诱发

　　凋亡途径而导致细胞死亡^［3］。近期报告用流式细胞仪分析顺铂诱导成人神经细胞瘤细胞株

　　SH-sysy细胞凋亡时，发现细胞通过G2/M期的阻制而产生凋亡^［4］。由此可见，顺铂诱导肿瘤

　　细胞凋亡可能与其抑制细胞生长作用密切相关^［5］。尽管顺铂为主的局部化疗对膀胱肿瘤的疗

　　效已被临床证实^［6］，但有关顺铂杀瘤作用的确切机理尚未清楚。本组实验发现顺铂诱导膀胱

　　癌细胞凋亡具有药物浓度和作用时间的依赖性。广泛性的细胞凋亡需要适宜的药物浓度和作用

　　时间，与文献报告顺铂诱导其它肿瘤细胞凋亡的结果十分相似^［7］，提示顺铂的杀瘤效应可能

　　产生于以细胞的程序化死亡为中介的一系列有条理的过程。因此，有理由认为药物诱导肿瘤细

　　胞凋亡的能力可作为临床化疗选择的客观依据。

附表　P53基因表达和顺铂作用时间的变化

　　P53基因在细胞凋亡中的作用是当前研究热点。已知P53基因具有两种构型：野生型P53是

　　抗癌基因，变异型P53具有癌基因活性。P53-Wt是一种高度磷酸化的核抗癌蛋白，没有PAb21表

　　位，在它的羧基端(人)315、392位点和氨基端5、9、20、33及90-99序列上丝氨酸磷化对DNA

　　结合和发挥抗增殖效应十分重要^［8］。通过cDNA诱导转化癌细胞实验表明：P53-Wt能够抑制

　　细胞增殖和动物癌瘤形成。近年研究表明P53蛋白可刺激CipL基因产生分子量为21 000的蛋白，

　　这种蛋白抑制cdk2基因的活性。cdk2基因编码的P34cdk2激酶是细胞分裂增殖的信号，它具有启

　　动DNA复制和诱发有丝分裂的双重作用。因此，有两种解释：(1)P53蛋白使细胞暂时停滞于G₁

　　期，在P53蛋白诱导产生抑制物消失后，这种作用即消失。(2)P53引起的生长停滞是永久的，结

　　果引起细胞凋亡。本组实验证实，顺铂诱导膀胱癌细胞凋亡过程中，随凋亡指数上升，P53-Wt

　　的阳性表达率呈上升趋势，二者呈正相关。且随凋亡细胞数增多，P53-Wt阳性多点表达率也明

　　显升高，由此可见一核多点表达现象可能是P53-Wt高表达的特征之一。提示P53-Wt基因参与顺

　　铂所致的DNA损伤可对膀胱癌细胞凋亡实施调控。

　　膀胱肿瘤约40%染色体11P缺失，C-Ha-ras基因位于该染色体。已发现在低分化，恶性度高的膀胱癌细胞P21染色为强阳性，正常膀胱粘膜为阴性，且它的表达产物Pras集中分布于核膜内侧^［9］。本组实验显示C-Ha-ras基因阳性信号均在核膜内侧，半月状贴于核膜下，与其十分相似。许多研究表明，bc1-2基因表达增强是抑制细胞凋亡最明显的现象。P53基因下调bc1-2基因产生细胞凋亡现象^［10］。C-Ha-ras和bc1-2同属具有转录活性基因，本组实验也表明，C-Ha-ras基因的阳性表达率和凋亡指数成负相关。C-Ha-ras基因可能在此细胞凋亡过程中失去了促进肿瘤细胞增殖活性，发挥其促进凋亡的中介作用。

　　资料表明，单独ras基因和单独P53基因的作用是有限的，单独ras基因突变激活后，即使其基因产物达到致癌水平而不能致癌；P53基因的突变和激活ras基因在转化过程中发挥协同转化效应^［11］。本组实验结果P53-Wt和C-Ha-ras基因与细胞凋亡密切相关，而两者阳性表达率呈相反的变化趋势。由此推测P53-Wt基因可能下调C-Ha-ras基因的表达而发挥其抑制细胞增殖活性，促进癌细胞凋亡的发生。某些抗癌基因的表达可能有利于降低抑制肿瘤细胞凋亡的基因产物或信号传导通路，导致增加或直接诱导细胞凋亡的发生。然而，彻底阐明癌基因和抗癌基因在化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡过程中的调控机理，尚有许多问题等待深入探讨。

　　参　考　文　献

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(收稿：1997-08-01　修回：1998-02-12)