支气管肺泡灌洗液端粒酶活性检测对肺癌诊断的价值

中国内镜杂志 2000年第1期第6卷 研究报告

作者：王锋　黄海蓉　王国斌　叶德普

单位：河南省胸科医院　郑州 450003

关键词：支气管肺泡灌洗液； 端粒酶； 诊断肺癌

　　目的：探讨通过支气管肺泡灌洗液（BALF）端粒酶活性检测诊断肺癌的实际价值。方法：应用端粒酶重复序列扩增记录法改进方法对30例肺癌患者的BALF进行端粒酶活性检测，并以10例非肿瘤患者的BALF作为对照。结果：肺癌组BALF中有26例（86．7％）表达阳性，非肿瘤组有1例（10％）表达阳性（P＜0．01)。肺癌组中小细胞癌表达阳性率为81．8％，非小细胞肺癌为89．5％，两组间无显著差异。镜下见肿瘤病变者表达阳性率95．0％，未见肿瘤病变者（周围型）亦可达70.0％。结论：对肺癌经纤支镜取BALF测定端粒酶的活性阳性率高，特异性亦佳；对肺癌的诊断尤其是周围型者可能很有价值；扩增结果用银染方法显示较放射自显影同样敏感，且经济又无同位素污染。

　　分类号　R768.1　R734.2

　　近年的研究发现：hTR在97％的肿瘤中都有较高的表达，而在正常组织中很少表达。当前对端粒酶活性检测在肺癌诊断中的应用研究还很少，为此，我们应用改进的TRAP法检测了40例支气管肺泡灌洗液中端粒酶活性，以探讨端粒酶检测对肺癌特别是周围性肺癌的诊断价值。现报道如下：

　　1　材料与方法

　　1.1　研究对象与支气管肺泡灌洗液取材

　　收集于1997年4月～6月在我院气管镜室行纤维支气管镜检查者支气管肺泡灌洗液（BALF）共40例。其中肺癌30例，为经纤支镜直观见新生物或未见新生物，但经纤支镜活检标本或手术标本证实者，包括SCLC 11例，NSCLC 19例。另外10例为非肿瘤疾病者，经临床、细菌学、X线或纤支镜活检病理确诊，均为肺部炎性疾病。在纤支镜观察后活检之前用生理盐水约20ml对新生物所在叶段进行冲洗并回吸，获得3～5ml BALF，未见新生物者冲洗导管插入病灶所在肺段支气管冲洗后回吸。标本均于取材后3h内3?000r／min分离10min，弃上清后立即放入液氮中速冻备用。

　　1.2　实验方法　

　　端粒酶提取：根据离心沉淀物的多少加入50～300μl冰冻裂解缓冲液（0．5％CHPs，10mM Tris-HCl，1mM MgCl₂，1mMEGTA，5mMBME，0．1mM PMSF，10％甘油)，冰上孵育30min，4℃16?000 r/min离心20min，取上清液，液氮中保存备用。应用753B微机型数显紫外线分光光度计测定端粒酶提取液中蛋白浓度，稀释到3μl备用。PCR扩增：采用50μl反应体系,加入2μl端粒酶提取液到反应体系中（20mM Tris-HCl，68mM KCl，1.5mM MgCl₂，1mM EGTA），0.1μg第一引物TS，0．5μM T₄G₃₂蛋白，50μM dNTP，3UTaq酶，室温孵育30min。90℃90s灭活端粒酶。加入第二引物0.1μgCX，94℃/45s→45℃／45s→72℃／1min，40个循环。最后一步72℃延伸4min。电泳：12％聚丙烯酰胺凝胶80V电压电泳3.5h。银染聚丙烯酰胺凝胶^［1］。

　　1.3　质量控制和统计学处理

　　5μl端粒酶提取液与1μl（1μg／μl）的RNA酶混合，37℃孵育20min，之后2μl的混合液用于端粒酶分析。RNA酶因能破坏端粒酶而出现抑制结果，单独孵育20min端粒酶阳性的提取物则无抑制结果出现。采用四格表资料的χ²检验对结果进行分析。

　　2　结果

　　以聚丙烯酰胺凝胶膜上出现4条或4条以上连续色带组成的“梯带”为端粒酶活性阳性。若RNA酶能抑制结果出现，则为真正阳性（见附图）。

附图　端粒酶重度序列扩增记录法电泳结果

　　图中纵行条带凡显示4条以上横行梯带者均属阳性(第2、5、6、7、8条为阳性)

　　经纤支镜作支气管肺泡灌洗（BAL）者共40例，其中肺癌者30例，非肺癌者10例，男性29例，女性11例。肺癌30例中端粒酶阳性者26例，阳性率为86．7％。非肺癌肺疾病10例中1例阳性，占10％。表明肺癌者有较高阳性率。

　　不同病理类型肺癌（小细胞癌SCLC，非小细胞癌NSCLC）BALF中端粒酶阳性率见表1，两组间无显著差异。纤支镜下可见病灶组与未见病灶组（均为活检及手术定诊者）BALF中端粒酶阳性情况见表2所示。镜下可见病灶组阳性率稍高于未见病灶组(X线显示有病灶），但统计学无显著差异（P＞0．05）。

表1　不同病理类型肺癌BALF中端粒酶阳性率

　　注：SCLC组与NSCLC组比较χ²＝1．32　P＞0.05

表2　纤支镜下见病灶与不见病灶组BALF阳性率的比较

　　注：镜下见病灶组与未见病灶组比较χ²＝1．76　P＞0.05

　　3　讨论

　　1989年，Morin^［2］首次采用Southern杂交的方法在人类Hela氏细胞系中检测到端粒酶活性。由于这种方法需要大量细胞，故对临床标本的检测受到限制。TRAP法借助PCR的方法，通过对端粒酶逆转录产物的检测间接反映了端粒酶活性的存在，具有敏感性高的特点，只需要100个以上肿瘤细胞即可检测。因此，我们采用改进的TRAP法，检测了30例肺癌患者的BALF，总体阳性率为86．7％，对照组非肺癌疾病的BALF阳性率为10％。这一研究结果与直接检测肺癌标本的阳性率85％接近^［4］。这表明BALF中端粒酶活性检测确有较高的敏感性，对术前确诊肺癌可能有重要意义。

　　文献报道^［3］经纤维支气管镜介导的肺癌诊断的结果：活检阳性率为65％～78％，针吸为75％～86％，痰脱落细胞检查肺癌阳性率为61.1％。本组肺癌BALF中端粒酶活性阳性率86．7％，与上述纤支镜活检和针吸阳性率比较接近，而较痰脱落细胞检查为高，研究中我们发现，1例SCLC患者，BALF端粒酶活性检测阳性，而纤支镜活检、刷检和BALF细胞学检查均阴性，后经手术证实为SCLC。

　　更值得注意的是，本组纤支镜未能窥及肿瘤病变而X线胸片显示肺内病灶，并手术证实的周围性肺癌10例中7例的BALF端粒酶阳性（70％）。这表明BALF查端粒酶可能是诊断周围性肺癌的重要方法。

　　在检测方法上我们采用经济，便于操作的银染方法，不仅没有降低敏感性，而且还有结果可以较长时间保存的优点，同时又避免了采用Kim原始方法所造成的放射污染，为扩大临床应用提供了方便。

　　本研究对照组非肺癌疾病10％出现端粒酶活性，较国外手术标本直接检测结果5％为高。可能原因有：本组标本例数少造成的抽样误差；取材和实验中污染造成的假阳性。此外本组SCLC阳性率低于NSCLC者，虽然统计学无显著差异，但这与Hiyama^［4］对肺癌手术标本的检测结果稍有不符（SCLC100％，NSCLC82％，P＜0.05）。这可能因抽样误差或取样过程差异造成，但更有可能是与不同类型肿瘤生物学特点有关。占非小细胞肺癌大多数的鳞癌在纤支镜下常为腔内生长呈结节状或菜花状，表面细胞容易脱落，而小细胞肺癌常呈粘膜下生长，表面光滑细胞不易脱落，这需要更多的标本来证实。

　　参　考　文　献

　　1，Brant JB， Gustano CA， Pteter MG. Fast and sensitive，silverstaining of DNA in polyacrylamide ge1s.Analytical Biochemistry， 1991;196：80

　　2，Morin B.The human terminal transferase enzgmt.is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeat.Cell,1989;59（498）：521

　　3，全国肺癌诊断与治疗新进展学术研讨会会议纪要.中华结核和呼吸杂志，1995；18：264

　　4，Hiyama K，Hiyama E，Ishioka S，et al.Telomrase activity in Small cell lung cancer and non small cell lung cancer.J Natal Can lnst， 1995;87：895