多基因单链构象多态性技术在大肠癌多基因突变联合测定中的应用

中华医学检验杂志 1998年第6期第0卷 论著摘要

作者：李欣　俞守义　丁彦青　Hongming Q.　周军　郑树

单位：510515 广州第一军医大学流行病学教研室(李欣、俞守义)，病理学教研室(丁彦青、周军)；Cancer center, The university of Texas (Hongming Q.)；浙江医科大学肿瘤研究所(郑树)

　　多基因单链构象多态性(MSSCP)是一种与多基因聚合酶链反应(PCR)联合应用，一次性快速测定多基因突变的方法^［1］。本研究建立了测定APC基因突变聚集区域(MCR)和K-ras第12/13密码子突变的MSSCP技术。

　　一、材料与方法

　　1.样本收集：收集34例确诊的散发性大肠癌组织和21例正常人组织，同时收集30例确定有APC(MCR)或K-ras(第12/13密码子)基因突变和27例无突变散发性大肠癌组织。

　　2.多基因SSCP分析：(1)引物设计与合成：按多基因PCR引物设计原则，在APC基因MCR区域设计3对引物，在K-ras基因第12/13密码子两侧设计1对引物。(2)多基因PCR扩增。(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳：5μl多基因PCR产物，加3倍体积上样缓冲液，煮沸10分钟，猝冷 2～3分钟，8%聚丙烯酰胺凝胶(29∶1)电泳4～5小时。银染、干燥保存和分析异常泳带。

　　3.真实性评价方法^［1］。

　　二、结果

　　1.多基因PCR及MSSCP方法的建立：将4对引物混合，进行PCR扩增。空白对照未见产物，组织标本可见4条清晰条带。MSSCP结果经银染，由单基因SSCP单链定位，在相应区域可见单链条带正常或异常泳动。

　　2.真实性评价：MSSCP灵敏度、特异度分别为96.7%(29/30)和88.9%(24/27)；各单基因SSCP特异度分别为100%(27/27)和96.3%(26/27)，而灵敏度分别仅为40%(12/30)和70%(21/30)，并联分析后的灵敏度为100%，特异度为96.3%(26/27)。

　　3.散发性大肠癌34例临床标本MSSCP测定：K-ras(12/13)阳性8例(23.5%)；APC(MCR)阳性5例(14.7%)；K-ras+APC阳性8例(23.5%)。共计阳性21例(61.8%)，APC(MCR)突变总检出率为38.2%，K-ras第12/13密码子突变总检出率为47.1%。21例正常组织未见突变。

　　三、讨论

　　检测肿瘤相关基因的突变，有望在早期发现肿瘤高危个体或临床前期病人。目前单基因突变测定阳性率偏低，甚至低于30%^［2］，限制了这类方法的实际应用。国外于1992年提出多基因突变联合测定的策略，以提高阳性检出率^［3］，但多个基因突变测定，过程繁琐，费用昂贵。MSCCP方法能有效地解决这类问题。真实性分析表明MSSCP方法在一次性快速测定基础上，灵敏度和特异度基本一致于单基因测定后的并联结果。对临床标本进行MSSCP测定，突变检出率达61.8%，而单基因测定，检出率在38.2%～47.1%，表明MSSCP能一次性快速而有效地提高基因突变的检出率。本研究方法仍有待于在更大样本或前瞻性观察研究中作进一步评价。

　　参考文献

　　1　曾光，主编.现代流行病学方法与应用.北京医科大学中国协和医科大学联合出版社.1993.61-74.

　　2　黄健，郑树，金胜航，等.散发性大肠癌APC基因突变研究.中华肿瘤杂志，1996，8：41-43.

　　3　Michael jB. Translational research and epithelial carcinogenesis: molecular diagnostic assays now-molecular screening assays soon? J Natl Cancer Inst, 1995,87：1041-1043.

(收稿：1998-04-03　　修回：1998-08-27)