大肠癌人巨细胞病毒感染与p53基因突变的相关性

　　中国肿瘤临床1999年第26卷第6期

侯治富　王维忠　杨绍娟　张文岚　吴晓冬　徐殿文

　　关键词：大肠癌巨细胞感染 p53基因突变

　　尽管人巨细胞病毒（HCMV）感染与人类肿瘤的关系还不十分清楚，但HCMV感染可导致原癌基因（如myc基因）的表达、生长因子转录、白细胞介素合成增加，酪氨酸羟化酶、多巴胺－β－羟化酶表达减少等。还有实验证实，神经胚细胞瘤体外培养中感染HCMV后，增加了瘤细胞的动能性（motility）和转移性。近年的临床研究中，报道了HCMV与宫颈癌关系十分密切，但有关大肠癌的报道较少。本文就大肠癌HCMV感染与p53基因突变关系进行了初步研究。

　　1　材料与方法

　　1.1　标本来源

　　收集1994～1996年白求恩医科大学中日联谊医院外科切除大肠癌组织共60例，均经病理证实，并进行了Dukes′分期和组织分化程度分型。患者年龄38～72岁；男42例，女18例。

　　1.2　DNA模板制备

　　取－80℃冻存组织约1g，经组织研磨器研磨，加入1mlDNA裂解缓冲液，置55℃1小时，95℃15分钟，经13000rpm离心10分钟，上清即为DNA模板。再0.8％～1％低电渗琼脂糖凝胶电泳，以排除降解的模板。

　　1.3　PCR－SSCP检测p53突变

　　取上述DNA模板液10μl（约1μg），加入50μlPCR反应体系内 （dNTP250μmol/L,MgCl23.0mmol/L;KCl25mmol/L：TagDNA聚合酶2U;引物浓度为0.25pmol/L）。p53基因第2,3外显子引物P1:5′－CCCACTTTTCCTCTTGCAGC;P2:3′－AGCCCAACCCTTGTCCTTAC,PCR产物长度为278bp;第4外显子引物P1:5′－CCCTGTCATCTTCTGTCCCT;P2:3′－AGCCCCAGTGGGCAACTGA,产物长度为121bp；第5外显子引物P1:5′－TCTGTTCACTTGTGCCCTGACTTTC;P2:3′－ACCCTGGGCAACCAGCCCTGTCGTC,产物长度为282bp。PCR循环参数为：95℃充分变性5分钟，再行95℃60秒，55℃50秒，72℃120秒，共35个循环，最后72℃充分延伸5分钟。取PCR产物8μl，与6倍加样缓冲液混匀，加于2％低电渗琼脂糖凝胶电泳，5v/cm，30分钟后经EB染色，在紫外反射透射仪上观察扩增效果。阳性者，取PCR产物7μl，与36％甲酰胺、0.05％溴酚蓝混合，95℃加热变性5分钟，置冰水冷却，取7μl加入含10％甘油、12％非变性聚丙烯酰胺凝胶，室温下以5v/cm电泳4～6小时。同时做阳性、阴性DNA和空白对照，EB染色20分钟后用紫外反射透射仪观察结果。

　　1.4　HCMVPCR检测

　　DNA模板制备同上。HCMVPCR引物序列P1:5′－CCACCCGTGGTGCCAGCTCC－3′；P2.5′－CCC,GCTCCTCCTGAGCACCC－3′,产物长度159bp。PCR循环参数为94℃60秒，52℃120秒，72℃120秒，总共35个循环。产物鉴定经2％琼脂糖凝胶电泳，5v/cm，1小时，用EB染色20分钟，紫外反射透射仪上观察结果。

　　1.5　统计学方法

　　实验所得计数数据采用Kendall等级相关分析和χ2检验。显著性差异标准定于P≤0.05。

　　2　结果

　　2.1　大肠癌HCMV感染与大肠癌组织分化、临床Dukes′分期的关系

　　在60例大肠癌中，HCMVPCR阳性检出率为31/60(51.67％)；不同组织分化的HCMV感染率分别为：高分化型43.75％，中分化型50.00％，低分化型55.55％，未分化型62.50％。Dukes′分期中，B1期为50.00％，B2期为50.00％，C1期为45.83％，D期为62.50％。经χ2检验和Kendall等级相关分析显示各组间HCMV感染率无显著差异（χ12=0.85，χ12=0.002，P＞0.05，τ1=0.07，τ2=0.003）。

　　2.2　大肠癌HCMV感染与p53基因突变的关系

　　在31例HCMV感染的大肠癌中，p53基因突变率为29.03％(9/31)，与非HCMV感染组比较，p53基因突变率显著增高（χ2=4.80,P＜0.05，τ＝0.11）。

　　2.3　大肠癌HCMV感染与大肠癌不同分化程度、临床分期中抑癌基因p53突变的关系（表1,2）。

　　表1，2可见，HCMV感染与大肠癌的组织分化程度、p53基因突变无显著差异（χ2=0.63和1.59，P＞0.05）；HCMV感染的病例，Duhes′分期越晚p53基因突变率越高，各组间差异显著（χ2=4.10,P＜0.05）。

表1　大肠癌HCMV感染与大肠癌组织分化程度、p53基因突变的关系

　　 HCMV(＋)组χ2=0.63　P＞0.05　Kendall　τ=0.08　HCMV(－)组　χ2=1.59　P＞0.05　Kendall　τ=0.07

表2　大肠癌HCMV感染与Dukes′分期、p53基因突变的关系

　　 HCMV(＋)组χ2=4.10　P＜0.05　Kendall　τ=0.07　HCMV(－)组　χ2=1.53　P＞0.05　Kendall　τ=0.07

　　3　小结

　　大肠癌的病因尚未明确，多数认为是一种多基因参与、多阶段演变的疾病。Kovacs等研究了HCMV感染的脐静脉内皮细胞p53基因呈现过度表达，而且主要集中在细胞核内，呈与细胞浆分离的状态。Cinatl等发现，HCMV感染使Bcl－2基因过度表达。本组资料中的60例大肠癌HCMVPCR阳性率为51.67％，明显高于本地区献血员。经Kendall等级相关分析发现，HCMV感染与大肠癌的Dukes′分期、组织分化的程度无关，但HCMV感染与p53突变有关；p53基因突变率随病情进展而增加，这一改变与组织分化程度无关。证实了大肠癌中p53基因突变与HCMV感染密切相关，其确切机理尚需进一步研究。

　　基金项目：本文课题受吉林省卫生厅科研基金资助作者单位：侯治富　王维忠　杨绍娟　张文岚　吴晓冬　白求恩医科大学第三临床学院中心实验室（长春市130031）

　　徐殿文　吉林省四平市妇婴医院