维生素E琥珀酸酯抑制人胃癌细胞生长的研究

卫生研究 2000年第3期第29卷 论　著

作者：刘柏合　吴坤　赵丹阳

单位：赵丹阳（黑龙江中医药大学方剂教研室）；刘柏合　吴坤（哈尔滨医科大学公共卫生学院，哈尔滨　150001）

关键词：维生素E琥珀酸酯；人胃癌细胞(SGC-7901)；α-生育酚

　　摘要：采用体外细胞培养的方法，观察维生素E琥珀酸酯(VES)对人胃癌细胞(SGC-7901)生长的影响，并利用MTT法比较VES和α-生育酚对胃癌细胞生长的作用效果。结果表明：VES(5、10和20μg/ml)对胃癌细胞生长有明显抑制作用，而α-生育酚在同样剂量对肿瘤细胞生长无抑制作用。这提示VES具有不同于维生素E的抗癌机理。

　　中图分类号：Q566　R735.2　　　　　　文献标识码：A

　　文章编号：1000-8020(2000)03-0172-03

Inhibition of human gastric carcinoma cell growth by vitamin E succinate

Liu Baihe, Wu Kun, Zhao Danyang

　　(The Public Health School of Harbin Medical University, Harbin 150001，China)

　　Abstract：The effects of vitamin E succinate(VES) on the growth of human gastric carcinoma cell (SGC-7901) were examined and compared with the effects of α-tocopherol by MTT assay. It was found that VES(5,10 and 20　μg/ml)inhibited cell growth significantly, but α-tocopherol did not show any inhibition effects. The results showed that the anticancer effect of VES and the anticancer mechanism of VES is different from α-tocopherol.

　　Key words:vitamin E succinate, human gastric carcinoma cell (SGC-7901), α-tocopherol

　　维生素E(Vitamin E, V_E)是一种发现较早的维生素，至今在自然界共发现8种类似物(即：α、β、γ、δ-生育酚和α、β、γ、δ-生育三烯醇)，其中以α-生育酚为主。V_E作为一种脂溶性抗氧化剂和自由基清除剂引起人们的重视，临床上将其用于动脉粥样硬化和慢性肾功能衰竭的治疗^［1］。近年来，V_E抗肿瘤作用逐渐被认识，并引起广泛的关注。维生素E琥珀酸酯(Vitamin E Succinate,VES)是天然的维生素E衍生物，它是由琥珀酸与α-生育酚的6位羟基成酯而形成的化合物。现已证明：VES对肿瘤细胞生长也具有抑制作用^［2，3］。本研究通过用VES处理人胃癌SGC-7901细胞，观察VES对人胃癌细胞生长的影响，并比较VES和α-生育酚对胃癌细胞的作用效果，以探讨VES的作用机理。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　试剂　RPMI-1640购自Gibco公司；噻唑蓝(MTT)、VES、α-生育酚均购自Sigma公司。

　　1.1.2　SGC-7901细胞的培养　人胃癌细胞(SGC-7901)购自北京市肿瘤研究所。细胞在含有10%新生牛血清、青霉素(100U／ml)、链霉素(100μg/ml)和2mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养液中，于37℃ 5%CO₂培养箱中常规培养。

　　1.1.3　VES溶液的配制　用无水乙醇将VES配制成浓度为10mg/ml的储备液，使用前根据细胞毒性试验，将VES储备液用含10%新生牛血清的1640培养液分别稀释成5、10和20μg/ml的VES使用液，VES使用液中无水乙醇的浓度为1μl/ml。

　　1.2　方法

　　1.2.1　生长曲线的测定　将SGC-7901细胞以每孔2×10⁴个接种于24孔板中，于CO₂培养箱中常规培养24小时。然后将培养液分别换成空白对照液(含1μl/ml乙醇、10%新生牛血清的1640培养液)和不同浓度VES的使用液，继续培养7天。每天换液一次，并将空白组和VES处理组细胞各消化4孔，台盼蓝染色，置血球计数板内计数活细胞数。以每天活细胞数均值绘制生长曲线，及计算VES对SGC-7901细胞的生长抑制率。

　　1.2.2　细胞成集落实验　将SGC-7901细胞以每孔500个接种于24孔板中，于培养箱中培养24小时。把培养液分别换成空白对照液和不同浓度VES使用液，再培养24或48小时。然后将培养液换成含10%新生牛血清的1640培养液，继续培养10天。细胞用PBS缓冲液清洗后，甲醇固定，Giemsa染液染色，计算每孔的集落数。50个细胞以上者算一个集落，并按下列公式计算集落形成率：

　　1.2.3　细胞分裂指数的测定　将细胞接种于含盖玻片的6孔培养板中，每孔加5.0×10⁵个细胞，常规培养24小时。然后把培养液分别换成空白对照液和不同浓度VES使用液，继续培养24或48小时。将细胞用PBS缓冲液清洗后，甲醇固定，Giemsa染色，显微镜下计数1000个细胞及其中的分裂细胞数，并按下列公式计算分裂指数：

　　1.2.4　MTT法比较VES和α-生育酚对细胞生长的影响　将细胞以每孔5000个接种于96孔培养板中，常规培养24小时后，将培养液换成空白对照液和不同浓度VES使用液及含α-生育酚10%新生牛血清的1640培养液，继续培养6天。各剂量组每天分别取细胞8孔，加入5mg/ml MTT 0.02ml，培养4小时，吸出培养液，加入0.2 ml DMSO,振摇10分钟后，用酶标仪在570nm波长下测定其光密度，并通过与对照值比较求出存活率：

　　2　结果

　　2.1　细胞的生长曲线

　　空白对照组和VES各剂量组细胞于24孔培养板中连续培养7天后，将各剂量组细胞每天计数4 孔细胞数的平均值绘制成生长细胞，结果见附图。

附图　VES处理的SGC-7901细胞的生长曲线

　　由附图可见对照组细胞于接种后第2天开始快速生长，第4天细胞数量已明显高于各VES组。而VES处理的细胞均受到不同程度的抑制，随着VES剂量的增加，这种抑制作用越明显。其中20μg/ml VES剂量处理的细胞在24小时后受到明显抑制，在第4天抑制率即将接近100%。5、10和20μg/ml VES处理细胞7天后，细胞生长的抑制率分别为41.2%、98.3%和100%。

　　2.2　细胞的集落形成率

　　由表1可见：各剂量VES对细胞成集落均有不同程度的抑制作用，并且随剂量和时间的增加，抑制作用亦明显增强。特别是20μg/ml VES处理细胞48小时后，集落形成抑制率达100%。

表1　VES处理的SGC-7901细胞的成集落情况(n=6)

剂量 　　(μg/ml)	细胞集落数(±s)		集落形成率 　　(%)		抑制率 　　(%)
	24h	48h	24h	48h	24h	48h
0	209.8±25.6	213.2±16.6	41.8	42.6	—	—
5	195.0±15.5	160.5±　9.6(1)	39.0	32.1	6.7	24.7
10	104.0±　9.4(1)	56.8±　9.5(1)	20.8	11.4	50.4	73.4
20	27.0±　4.9(1)	0(1)	5.4	0	87.2	100

　　注：与0μg／ml剂量组相比，(1)P＜0.012.3　细胞的分裂指数

表2　VES处理的SGC-7901细胞的分裂指数和抑制率(n=6)

　　注：与0μg/ml剂量组相比，(1)P＜0.01

　　由表2可见：用不同剂量VES处理细胞24或48小时后，各组细胞的有丝分裂均受到抑制，并且随剂量和作用时间的增加，抑制作用亦明显增加，抑制率由24小时的9.5%～86.4%，提高到48小时的16.7%～100%。

　　2.4　MTT法检测结果

表3　VES和α-生育酚对SGC-790细胞的存活率的影响(n=8)

　　不同浓度VES和α-生育酚处理细胞6天，每天用MTT法检测细胞的存活率。由表3可见：不同剂量的VES处理使各组细胞生长均受到抑制，其中10和20μg/ml剂量组细胞抑制效果显著，分别在第5天和第4天被完全抑制，与生长曲线结果基本一致。而与同样剂量的VES相比，各剂量组α-生育酚对SGC-7901细胞生长均未表现出抑制作用，相反在一定程度上对其生长还产生了促进作用，并且各剂量组细胞之间的存活率无显著差别。

　　3　讨论

　　V_E是一种天然的抗氧化剂，主要是由于在它的苯并二氢吡喃环的头部6位有游离的羟基，此羟基可与脂质过氧化自由基反应，产生一个相对稳定的脂质氢过氧化物，而阻断自由基链反应，达到抗氧化目的。目前研究发现V_E具有抑制肿瘤细胞生长作用，并认为其抗肿瘤作用与其抗氧化作用密切相关^［4］。

　　VES是通过与α-生育酚的6位游离羟基成酯而形成的V_E衍生物，以保护α-生育酚的6位羟基免于氧化，使α-生育酚在储存和运输中稳定性增加。最近研究显示：VES对多种肿瘤细胞生长有抑制作用，如大鼠神经胶质瘤细胞、人前列腺癌细胞、人早幼粒细胞、人乳腺癌细胞等^［5～8］，但其作用机理尚不清楚。

　　胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居肿瘤死亡率的前列，但目前尚无VES抑制其生长的报道，为此本文以人胃癌SGC-7901细胞作为离体实验模型，对VES进行了研究。实验结果表明：VES对人胃癌SGC-7901细胞的体外增殖有抑制作用，且随剂量增加，抑制作用亦增强。同时VES还可抑制胃癌细胞的核分裂和集落形成，抑制作用呈剂量-效应关系。为进一步研究VES的抗胃癌作用机理，我们选用VES的水解产物，即V_E中主要的抗氧化成分α-生育酚作为实验对象，利用MTT法比较其与VES对SGC-7901细胞生长的影响。结果显示，VES可抑制胃癌细胞生长，其抑制效果与生长曲线所测结果基本一致；而在相同剂量下α-生育酚对胃癌细胞并无任何抑制作用，且各剂量组之间细胞生长无显著差异。这一结果表明VES所具有的抑制胃癌细胞生长作用与α-生育酚无关，与国外学者Fariss等的报道一致^［9］，即VES是通过完整的结构来发挥其抗肿瘤作用。

　　综上所述，VES在体外对胃癌细胞具有明显的抑制作用，并且这种抑制作用不是通过其水解产物α-生育酚产生的，而是其通过完整的结构来发挥作用的。这表明VES不是通过抗氧化作用抑制胃癌细胞生长，因此具有不同于V_E的抗肿瘤机理。

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.39870662)

　　作者简介：刘柏合，男，博士研究生

　　参考文献

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　　5，Rama BN, Prasad N. Study on the specificity of alpha tocopheryl(Vitamin E) acid succinate effect on melanoma. glioma and neuroblastoma cells in culture. Proc Soc Exp Biol Med,1983,174：302—307

　　6，Isral K, Sander BG, Kline K. RRR-α-tocopheryl succinate inhibits the proliferation of human prostatic tumor cells with defective cell cycle／differentiation pathways. Nutr Cancer,1995,24：161—169

　　7，Turley JM, Sanders BG, Kline K. RRR-α-tocopheryl succinate modulation of human promyclocytic leukemia(HL 60) cell proliferation and differentiation. Nutr Cancer,1992,18：201—213

　　8，Charpentier A, Simmons-Menchaca M, Yu W, et al. RRR-α-tocopheryl succinate enhances TGF-β1,-β2 and-β3 and TGF-βR-Ⅱ expression by human MDA-MB-435 breast cancer cells. Nutr Cancer,1996,26:237—250

　　9，Fariss M. The selective antiproliferative effects of α-tocopheryl hemisuccinate ang cholestery1 hemisucccinate on murine leukemia cells result from the action of the intact compounds. Cancer Res,1994,54：3346—3351

(2000-01-12收稿)