巢式逆转录多聚酶链反应检测周围静脉血中肝癌细胞的敏感性

中华外科杂志 1998年第9期第36卷 论著摘要

作者：刘扬　张柏和　钱光相　陈汉　吴孟超　傅继梁　黄长辉

单位：200438 上海，第二军医大学东方肝胆外科医院(刘扬、张柏和、钱光相、陈汉、吴孟超)；第二军医大学生物教研室(傅继梁)；第二军医大学分子生物开放实验室(黄长辉)

　　 本研究拟应用巢式逆转录多聚酶链反应（巢式RT-PCR）检测不同稀释比例的周围静脉血液中存在的肝癌细胞，并探讨其敏感性。

　　1. 材料和方法：(1)细胞系选择：选择能分泌AFP的人肝癌细胞株SMMC-LINM（由本校病理解剖教研室提供），进行体外传代培养，显微镜下计数。(2)稀释血液标本的制备：抽取健康人周围静脉血液4.5 ml,与显微镜下计数的SMMC-LINM肝癌细胞进行倍比稀释。(3)有核细胞的制备：采用红细胞溶解法^［1］。(4)抽提细胞总RNA:采用异硫氰酸胍一步抽提法。(5)合成cDNA：应用Promega公司生产的反转录试剂盒，具体操作按制造商提供的资料进行。(6)巢式PCR：PCR循环条件参照文献［1］并略有改进。(7)电泳分析及PCR产物鉴定分析：用15%的聚丙烯胺凝胶电泳分析不同细胞稀释比例的PCR终产物。

　　2．结果：巢式RT-PCR检测周围静脉血液中SMMC-LINM株肝癌细胞的敏感性：人AFPmRNA特异性PCR产物可以从一系列稀释血液标本中观察到，其检测敏感性可达每5ml血液中仅存在6个以上SMMC-LINM肝癌细胞，巢式RT-PCR就可以检测到它存在的依据。

　　3．讨论：目前用于肝癌早期血液转移的检测尚无理想、可靠的方法，细胞学方法及免疫组化法有一定的特异性，但缺乏敏感性，其检测范围为1/10⁴～1/10⁵。鉴于此，我们试图应用一种敏感性高（可达1/10⁷），特异性强的方法，即巢式RT-PCR检测血循环中播散或转移的肝癌细胞。本研究表明，倍比稀释的血液中的SMMC-LINM肝癌细胞可以通过巢式RT-PCR敏感的检测到其存在的依据，其敏感性可达每5ml血液中只要存在6个肝癌细胞，这就意味着只要10⁷个单个核细胞中存在6个以上肿瘤细胞，巢式RT-PCR即可检测到它的存在，这与国外学者报道结果相似。目前，国外学者应用巢式RT-PCR已成功地进行了黑色素瘤、神经母细胞瘤、肝癌、前列腺癌等肿瘤细胞血液转移的检测^［1］，但国内目前尚无开展此项研究。

　　综上所述，巢式RT-PCR可以敏感的检测到血循环中播散或转移的肝癌细胞，它是一种敏感性高，特异性强的实用性检测方法。

　　本课题受军联重点实验基金资助

参考文献

　　1Komeda T,Fukuda Y,Sando T,et al.Sensitive detection of circulating hepatocellular cacinoma cells in peripheral venous blood.Cancer,1995,75:2214-2219.

　　（收稿：1997-10-03　修回：1998-06-20）