标记抗人肝癌单克隆抗体SPIO对荷瘤裸鼠的定位诊断作用

中国医学物理学杂志 1999年第4期第16卷 实验研究

作者：许乙凯　刘杏元　张嘉宁

单位：许乙凯　刘杏元　广州第一军医大学 南方医院影像中心；张嘉宁　第一军医大学 实验动物教研室 ,广东 广州 510515

关键词：肝癌；超顺磁性氧化铁粒子；磁共振成像

　　 　　摘要：　目的：探讨标记抗人肝癌单克隆抗体超顺磁性氧化铁粒子（McAb-SPIO）对荷瘤裸鼠模型的诊断作用。材料和方法：用过碘酸盐法将Hab-18抗人肝癌单抗标记到SPIO粒子；建立裸鼠载瘤模型（n=12只）。结果：实验组（n=8）从尾静脉注入0.3 mg Fe/20g的McAb-SPIO，给药后24小时成像观察到裸鼠瘤结均有选择性信号下降，对照组（n=4）在注射LgG-SPIO后未见明显信号改变。结论：McAb-SPIO磁共振免疫成像对肝癌的早期定性诊断有较高价值。

　　中图分类号：Q6-33　文献标识码：B

　　文章编号：1005-202X（1999）04-0260-03

Magnetic particles coated by monoclonal antibodies against human hepatocellular carcinoma for the diagnosis of nude mouse with liver tumor

XU Yi-kai, LIU Xing-yuan, ZHANG Jia-ning

( Medical Imaging Center, NanFang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515,China)

　　Abstract:　Purpose:To explore The efficacy of MR antibody imaging with superparamagnetic iron oxide particles (SPIO) coated by Monoclonal Antibodies (McAb) in the diagnosis of nude mice carrying liver tumors. Materials and Methods: McAb against human hepatocellular carcinoma coating SPIO was achieved with periodate method. 12 nude mice with the tumor were established by subcutaneously injection of QGY-7723 hepatocellular carcinoma cell line. The tumor grew up about 0.5-1.0cm in diameter was harvested for further MR study.Results: After i.v. injection of 0.3 mg/20 g body weight of McAb-SPIO, heterogeneous specific signal reduction was noticed in experimental group (n=8), while no obvious signal intensity changes in the control group (n=4) were founded after injection of nonspecific lgG-SPIO . Conclusion: McAb-SPIO enhanced MR imaging is a promising way for early diagnosis of tiny hepaticellular carcinoma nodules.

　　Key words:　hepatocellular carcinoma; superparamagnetic iron oxide particle; magnetic resonance imaging.

　　超顺磁性氧化铁粒子（SPIO）的化学成分是Fe₃O₄纳米级晶体，具有极强磁性，在若干nmol/L的低浓度下就可引起磁共振信号的显著改变^［1］。本文将尝试用抗人肝癌单克隆抗体（McAb）标记到SPIO上，用于裸鼠模型的肿瘤定向增强，现报道如下：

　　1　材料和方法

　　1.1 McAb来源及SPIO粒子的标记

　　McAb采用第四军医大学病理教研室制备的鼠源性抗人肝癌单抗（Hab18），为lgG1亚型，经纯化后浓缩至10 mg/ml，无菌分装后置于-80℃冰箱存放。SPIO的制备及与McAb标记反应（高碘酸盐法）详见前文报道^［2］，制备成的McAb-SPIO复合物通过DEAE离子交换拄（柱长45 cm），进一步分离McAb-SPIO与McAb单体，再浓缩至含铁量为5 mgFe/ml于4℃保存备用（含铁量采用常规原子吸收光谱法测定），其电镜下形态见（图1）。

图1　McAb-SPIO电镜下所见（放大3万倍）。电子致密部分即为SPIO粒子，大小约5～30 nm，成簇分布

　　用同样方法制备出标记正常鼠lgG（非特异性）lgG-SPIO，同样浓缩至5 mgFe/ml，作为阴性对照。

　　1.2　McAb-SPIO免疫活性测定

　　向含有1 ml QGY-7723肝癌细胞的混悬液的2支试管内（细胞数为2×10⁵个/ml），分别加入0.5 ml McAb-SPIO和lgG-SPIO，于37℃孵育2小时，然后用生理盐水离心洗二次，再离心收集细胞沉淀，分别向各管加入65% HNO₃（0.5 ml）和0.1 ml H₂O₂在100℃消化，用原子吸收光谱法测各管的含铁总量

　　1.3　标记前后SPIO的弛豫时间变化

　　取内径0.5 cm试管，将McAb-SPIO按0，0.5，1.0，1.5 mg Fe/ml的浓度梯度配制；按同样浓度梯度配制一般SPIO液，同时置于我院Siemens Vision Plus MR 仪用头部线圈扫描（Carr-Purcell-Meiboom-Gill序列，8个回波，TR=2000 ms，TE分别为14，28，......，112 ms）测定并比较标记前后SPIO各管的T₂值（SPIO主要缩短T₂值，对T₁值影响小，故只测定T₂值变化）。

　　1.4　肝癌裸鼠模型的建立及McAb-SPIO的定向增强作用

　　将QGY-7721肝癌细胞按7×10⁶个/ml接种于6周龄鼠（n=12，由第一军医大学动物中心提供）颈部皮下，3周后肿瘤生长至0.5～0.8 cm。

　　实验前24小时裸鼠均从尾静脉注入墨汁0.5 ml，目的是预先封闭网状内皮系统，然后将动物分为二组，实验组8只分别从尾静脉注入0.3 mg Fe/20 g体重的McAb-SPIO，对照组4只则从尾静脉注入同样含铁量的lgG-SPIO，二组动物均分别在增强前及增强后第24小时行MR扫描，获T^*₂加权像（Turbo FLASH序列，是检测SPIO强化效应最敏感成像序列），翻转角20°，TR 600 ms，TE 15 ms，层厚3 mm，矩阵256×256），比较瘤灶信号强度变化。

　　2　结果

　　2.1　McAb-SPIO的免疫活性估测

　　加入McAb-SPIO管内的含铁总量为1.9 mg，而对照管（加入LgG-SPIO）的含铁总量仅为0.3 mg，表明McAb-SPIO仍保持较高的免疫活性，与靶细胞（QGY-7723）有特异结合

　　2.2 标记前后SPIO对T₂弛豫值影响（表1）

表1　标记前后SPIO对T₂值（ms）影响

配对t检验，二管T₂值无显著差异（P＞0.05）

　　从表上可见，标记McAb后对SPIO的造影效果无明显影响

　　2.3　McAb-SPIO对裸鼠瘤灶的定向强化作用

　　裸鼠皮下瘤结在T₂^*加权像上均呈中等偏高或高信号，实验组注射McAb-SPIO后，瘤结信号强度多有轻、中度降低，表现出等或低信号（图2，3）。而对照组注射lgG-SPIO后，瘤结信号未见明显降低。

图2　T^*₂加权冠状像显示裸鼠皮下有类圆形高信号瘤结

图3　注射McAb-SPIO后24小时T^*₂加权像上，瘤结信号有所降低

　　3　讨论

　　本文实验表明，在SPIO（一种顺磁性示踪剂）的外周包被单克隆抗体Hab18，经静脉输注后，SPIO粒子可以借抗原（肝癌组织细胞）和抗体的特异性结合逐渐浓聚在裸鼠肿瘤内部，由于SPIO粒子引起局部微观磁场的均匀性改变，导致氢质子横向弛豫的加快，T₂值缩短，因此，在对磁化率效应（Susceptibility effect）敏感的磁共振梯度回波序列所获T₂^*加权像上，可以观察到肿瘤的信号强度出现特异性的变化，有助于肝脏肿瘤的定性诊断，同时这种方法也有可能应用到其它肿瘤的磁共振免疫成像实践^［3］。

　　理论上，SPIO粒子虽具有比Gd元素更强的磁性，但SPIO粒子的体积较大，进入血循环后，容易受网状内皮系统的吞噬而被清除^［4］，为了克服这一问题，我们静注适量的墨汁使裸鼠体内的网状内皮系统预先封闭，从而减少McAb-SPIO在循环到达瘤靶前的损失。尽管采取了上述措施，但增强前后瘤靶的信号变化仍不理想，原因可能与标记后抗体的免疫活性仍有一定损失有关，此外，寻找更加理想的顺磁性标志物也是今后改进的方向。

　　本实验由于受到时间和条件的限制，未能就注射McAb-SPIO后瘤灶的动态增强时间曲线及最佳成像参数进行研究，这些均有待于今后进一步的探索。

　　参考文献：

　　1　Weissleder R. Papisov MI. Pharmaceutical iron oxides for MR imaging. Rev. Magn. Reson. Med. 1992; 4:1.

　　2　许乙凯，颜江华，张嘉宁,等.标记抗人肺癌单抗超顺磁性氧化铁粒子的磁共振免疫显像实验［J］，临床放射学杂志，1998；17（5）：310.

　　3　Tiefenauer LX, Kuhne G, Andres RY. Et al. Antibody-Magnetite nanoparticles: in vitro characterization of a potential tumor-specific contrast agent for Magnetic Resonance Imaging. Bioconjug. Chem 1993;4:347-352.

　　4　Bulte JWM, Hoekstra Y, Kamman RL et al Specific MR imaging of human lymphocyte by monoclonal antibody guided dextran-magnetite particles, Magn Reson Med 1992;52:148.

收稿日期：1999-04-10