乙型肝炎患者HBV DNA定量测定与临床疗效的关系

　　我们应用微板核酸杂交-核酸定量技术对86例乙型肝炎患者血清HBV DNA的定量测定以及其中11例应用IFNα2b治疗３个月前后血清HBV DNA的变化情况。

　　资料与方法：采用Primer软件设计引物，选取HBV DNA C区的保守序列作引物与探针，其序列分别为：引物W₁ TGGACGTCGCATGGAGACCACCGT GAA，引物W₂ GAAAGCTTCTGCGAC GCCGTGATTGAGA，包被探针GATCC AGCATCCGCGGATCTAGTAGTCAA TTATGTTAACACCAACATGGGCCT AAAGATCAGGCAAC，显色探针GGA

　　ATTAATGACTCTAGCTACCTGGGT GGGTAATAATTTGGAAG。把HBV DNA C区基因克隆到质粒中，在大肠杆菌中增殖，提取质粒DNA构建和定量标准品，用微量分光光度计测定质粒DNA浓度（100mg/L）。采用极限稀释法，将标准品1:10倍比稀释，作32次循环的PCR，其阳性最大稀释度为1:10⁵（相当于1μg/L）。选择有一定差异的５个浓度：80μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L、1μg/L为横坐标，吸光度（A）值为纵坐标准，作直线回归方程Y＝ax＋b，绘制标准曲线。选一定的线形范围作标准曲线，其相关系数（r）可达到0.99，其灵敏度最高可达到1μg/L。在37℃下，用碳酸盐缓冲液（pH9.6）等将包被探针在微板孔上包被14h。用封闭剂封闭微板孔非特异性结合位点。

　　结果：采用微板核酸杂交-核酸定量技术对86例不同临床表现的肝炎患者血清中的HBV DNA含量的测定结果（血清HBV DNA含量＜2μg/L定为A级，2μg/L～1mg/L为B级，＞1mg/L为C级）表明，27例急性重型肝炎的DNA含量均超过2μg/L，分布在B级和C级的比例为15:12；而急性轻型肝炎的血清HBV DNA含量84.21%（16/19）少于2μg/L。15例轻度慢性肝炎几乎平均分布在A级和B级（8:7）；9例中度慢性肝炎分布在B级和C级的比例为2:1；16例重度慢性肝炎分布在B级和C级的比例为1:3。说明84.2%（16/19）的急性轻型肝炎患者和53.3%（8/15）慢性肝炎轻度患者的HBV DNA含量少于2μg/L，66.7%（6/9）中慢性肝炎患者的HBV DNA含量分布于2μg/L～1mg/L，75.0%（12/16）慢性肝炎重度和44.4%（12/27）急性重型肝炎患者的血清HBV DNA含量分布在1mg/L以上的范围。

　　讨论：我们使用干扰能治疗的11例乙型肝炎患者中，急性轻型肝炎血清HBV浓度低，对干扰能反应好，其中１例已治愈。慢性肝炎血清HBV DNA在A级及B级的均有下降，症状好转，而在C级的无好转，血清HBV DNA无明显下降。可以看出血清HBV DNA＜110μg/L均对干扰能有较好反应，高于此浓度则对干扰能无明显反应。因此血清HBV DNA测定可作为干扰能治疗的预测标准；这与国外大多数学者认为血清HBV DNA＜20μg/L对干扰素治疗有较好反应的结果相近。但由于我们观察例数较少，时间短，治疗时间仅3个月，即使一部分有好转的病人，血清HBV DNA浓度仍在较高水平（Ｂ级），仍有待于进一步观察疗效以及注意其“反跳”现象。我们将基因扩增、核酸杂交和酶联显色三大诊断技术融为一体，发挥核酸杂交技术特异性强、PCR技术灵敏度高、ELISA方法信号检测方便的优点，发展了微板核酸杂交-ELISA技术。该方法杂交时间短、操作简单、自动化程度高，可大规模进行标本检测，且通过酶标仪及其计算机分析系统，可以进行核酸的定量测定，不但简单易行，而且稳定可靠、重复性好，可广泛应用于临床上判断疗效及评估病情，并可作为干扰素治疗的预测指标。

王虹 万成松 王省良 彭华国 张文炳

作者单位：510515

广州，第一军医大学基础部生物医学诊断研究中心