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乙型肝炎患者HBV DNA定量测定与临床疗效的关系
[ 中医中药秘方网 作者:王虹 ]

乙型肝炎患者HBV DNA定量测定与临床疗效的关系

  我们应用微板核酸杂交-核酸定量技术对86例乙型肝炎患者血清HBV DNA的定量测定以及其中11例应用IFNα2b治疗3个月前后血清HBV DNA的变化情况。

  资料与方法:采用Primer软件设计引物,选取HBV DNA C区的保守序列作引物与探针,其序列分别为:引物W1 TGGACGTCGCATGGAGACCACCGT GAA,引物W2 GAAAGCTTCTGCGAC GCCGTGATTGAGA,包被探针GATCC AGCATCCGCGGATCTAGTAGTCAA TTATGTTAACACCAACATGGGCCT AAAGATCAGGCAAC,显色探针GGA

  ATTAATGACTCTAGCTACCTGGGT GGGTAATAATTTGGAAG。把HBV DNA C区基因克隆到质粒中,在大肠杆菌中增殖,提取质粒DNA构建和定量标准品,用微量分光光度计测定质粒DNA浓度(100mg/L)。采用极限稀释法,将标准品1:10倍比稀释,作32次循环的PCR,其阳性最大稀释度为1:105(相当于1μg/L)。选择有一定差异的5个浓度:80μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L、1μg/L为横坐标,吸光度(A)值为纵坐标准,作直线回归方程Y=ax+b,绘制标准曲线。选一定的线形范围作标准曲线,其相关系数(r)可达到0.99,其灵敏度最高可达到1μg/L。在37℃下,用碳酸盐缓冲液(pH9.6)等将包被探针在微板孔上包被14h。用封闭剂封闭微板孔非特异性结合位点。

  结果:采用微板核酸杂交-核酸定量技术对86例不同临床表现的肝炎患者血清中的HBV DNA含量的测定结果(血清HBV DNA含量<2μg/L定为A级,2μg/L~1mg/L为B级,>1mg/L为C级)表明,27例急性重型肝炎的DNA含量均超过2μg/L,分布在B级和C级的比例为15:12;而急性轻型肝炎的血清HBV DNA含量84.21%(16/19)少于2μg/L。15例轻度慢性肝炎几乎平均分布在A级和B级(8:7);9例中度慢性肝炎分布在B级和C级的比例为2:1;16例重度慢性肝炎分布在B级和C级的比例为1:3。说明84.2%(16/19)的急性轻型肝炎患者和53.3%(8/15)慢性肝炎轻度患者的HBV DNA含量少于2μg/L,66.7%(6/9)中慢性肝炎患者的HBV DNA含量分布于2μg/L~1mg/L,75.0%(12/16)慢性肝炎重度和44.4%(12/27)急性重型肝炎患者的血清HBV DNA含量分布在1mg/L以上的范围。

  讨论:我们使用干扰能治疗的11例乙型肝炎患者中,急性轻型肝炎血清HBV浓度低,对干扰能反应好,其中1例已治愈。慢性肝炎血清HBV DNA在A级及B级的均有下降,症状好转,而在C级的无好转,血清HBV DNA无明显下降。可以看出血清HBV DNA<110μg/L均对干扰能有较好反应,高于此浓度则对干扰能无明显反应。因此血清HBV DNA测定可作为干扰能治疗的预测标准;这与国外大多数学者认为血清HBV DNA<20μg/L对干扰素治疗有较好反应的结果相近。但由于我们观察例数较少,时间短,治疗时间仅3个月,即使一部分有好转的病,血清HBV DNA浓度仍在较高水平(B级),仍有待于进一步观察疗效以及注意其“反跳”现象。我们将基因扩增、核酸杂交和酶联显色三大诊断技术融为一体,发挥核酸杂交技术特异性强、PCR技术灵敏度高、ELISA方法信号检测方便的优点,发展了微板核酸杂交-ELISA技术。该方法杂交时间短、操作简单、自动化程度高,可大规模进行标本检测,且通过酶标仪及其计算机分析系统,可以进行核酸的定量测定,不但简单易行,而且稳定可靠、重复性好,可广泛应用于临床上判断疗效及评估病情,并可作为干扰素治疗的预测指标。

王虹 万成松 王省良 彭华国 张文炳

作者单位:510515

广州,第一军医大学基础部生物医学诊断研究中心


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