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幽门螺杆菌的临床与实验研究
[ 中医中药秘方网 作者:赵世民、梁守德、梁玉珍、张学忍、贺建平、何志龙 ]

幽门螺杆菌的临床与实验研究

  从Warren和Marshall在1983年报道从慢性活动性胃炎病胃粘膜中成功地培养出螺旋形细菌以来,来自澳大利亚、英国、荷兰及我国不少研究结果均表明,该菌与慢性胃淡及消化性溃疡有密切关系,该菌为幽门螺杆菌(Helicobacter pylorides,简称Hp)。为了进一步研究Hp的致病性、分布及来源,我们对1000例内镜检查患者进行Hp微生物学及组织病理学检查,并对5只成年狗、10只分健康小白鼠及10只大白鼠进行有关Hp的实验研究,旨在评估与其它动物胃粘膜中Hp阳性率、临率意义及与慢性胃病的关系。

  1 材料和方法

  1.1 临床研究

  本研究对象为有化道症状进行内镜检查的1027例住院及门诊患者,经筛选后对1000例资料完整病例进行了统计,其中,男709例,女291例,年龄12岁~82岁,平均47.2岁,内镜或病理最后诊断为慢性浅表性胃炎518例,慢性萎缩性胃炎174例,胃溃疡56例、胃癌47例,胃息肉12例,十二指肠溃疡121例,十二指肠炎38例,食管炎28例,食管癌6例。病禁食12h,清晨空腹按常规准备后进行内镜检查,内镜用洗必泰和乙醇消毒,活检钳用同样方法处理,每个病除在病变部位活检外,均在胃窦距幽门2cm范围内取2~3个活检标本,分为两份,一份作细菌培养和双相快速诊断,另一份作组织病理学检查。

  组织学检查 活检标本在10%甲醛溶液中固定,然后按常规步骤制做病理切片。所有活检病理切片均做苏木-伊红(HE)染色,126例同时做Warthin-Starth染色,部分病例还做了革兰染色及电镜观察,发现Hp者为阳性,否则为阴性。

  微生物学检查 取新鲜标本一块,先在Hp选择性血脂平板涂抹,然后将该标本插入尿素酶快速诊断培养皿中,观察其反应,阳性者一般3min~15min即可在组织块周围出现红色反应环、反应环出现的快慢与大小和组织块内含菌量的多少成正比。尿素酶试验后,将原组织块取出放在作氧化酶测试的滤纸片上,3min~15min内组织粘膜部分变黑色者为阳性,表示有Hp存在,否则为阴性。组织块变黑的快慢也与Hp量成正比。我们称之为“双快试验”,Hp对双快试验均成阳性反应(双相阳性),有变形污染者尿素酶试验可呈阳性,而氧化酶试验阴性,假单胞菌属污染则尿素酶试验阴性,而氧化酶试验阳性,反以“双快试验”对Hp感染诊断有极重要的鉴别意义。用作细菌培养的平板置37℃微嗜氧环境或CO2环境中培养3d~4d。细菌生长后,对菌落特征、生化反应、形态学研究及多种抗生素、中药的药敏试验等项指标进行观察。

  1.2 动物实验

  取5只成年健康狗,用硫苯妥钠静脉麻醉后进行纤维内镜观察,并从胃窦小弯距离门2cm取活检两块、胃体小弯活检两块、分别进行细菌学检查及病理组织学检查。活检之后,由活检孔道插塑料导管,向胃注入事先制作的新鲜纯Hp活菌液5ml(含菌数约为108/ml)结束检查之后动物隔离饲养,于第二周再灌5ml,第3,4,5,6,7,8周各作内镜检查一次并活检,标本处理同前。取健康大白鼠10只,其中两只处死后取其全胃,于胃窦体各剪两块标本分别进行细菌学检查及病理组织学检查。其它大白鼠均用胃管向胃内注入纯Hp菌液1ml(含菌数同上)、第2周再灌1ml,于第3,4,5,7周各处死两只,取出胃标本进行细菌学及病理组织学检查,方法同前。取健康小白鼠10只,用与大白鼠同样的方法进行实验。

  2 结果

  2.1 临床研究

  1000例各胃十二指肠疾病中微生物学不同方法的Hp检出率见表1。以十二指肠球部溃疡、十二指肠球炎及胃溃疡的检出率最高。快速诊断阳性而培养阴性者18例,快速诊断阴性而培养阳性者25例。一例尿素酶试验阳性而氧化酶鉴测为阴性,经细菌学鉴定为大量变形菌污染。126例病理组织学切片用不同染色方法的Hp检出率见表2,其中细菌学阳性、切片阴性者12例,细菌学阴性切片阳性者3例。有16例胃溃疡患者的胃标本同时取自胃窦距幽门2cm以内胃粘膜及胃溃疡组织,取自胃窦粘膜的标本中有10例Hp微生物学检查为阴性,取自溃疡组织的标本及2例阳性。10例胃癌患者胃窦粘膜标本中有6例Hp阳性,取自癌组织的标本无一例阳性,这表明Hp不易在溃疡及癌组织中存在。

表1 胃十二指肠疾患1000例Hp微生物学检出率

内镜诊断

尿素酶(%)

氧化酶(%)

培养(%)

浅表性胃炎

244/518(47.1)

243/518(46.9)

127/305(41.6)

萎缩性胃炎

72/174(41.4)

72/174(41.4)

72/158(45.6)

胃溃疡

41/56(73.2)

41/56(73.2)

38/55(69.1)

胃 癌

24/47(51.0)

24/47(51.0)

11/45(24.4)

胃息肉

5/12(41.7.0)

5/12(41.7.0)

2/5(40.0)

十二指肠溃疡

98/121(81.0)

98/121(81)

99/119(83.2)

十二肠炎

30/38(78.9)

30/38(78.9)

20/38(73.7)

食管癌

2/6(33.3)

2/6(33.3)

 

食管炎

14/28(50.0)

14/28(50.0)

14/23(60.9)

合 计

530/1000(53.0)

529/100(52.9)

391/748(52.3)

表2 胃活检标本126例切片Hp阳性结果比较

内镜及病理诊断

n

W-S染色

HE染色

慢性浅表性胃炎

47

22(46.8)

20(42.5)

慢性萎缩性胃炎

18

6(33.3)

5(27.8)

胃 溃 疡

16

10(62.5)

10(62.5)

胃  癌

10

6(60.0)

6(60.0)

十二指肠球部溃疡

20

16(80.0)

15(75.0)

十二指肠炎

15

11(73.3)

10(66.7)

  Hp为革兰阴性杆菌,菌体常呈现弯曲状、或呈S形,短螺旋形及海鸥展翼形。主要位于胃粘膜的胃粘液层下,常集居成团,电镜下观察菌体表面带有光滑外衣,菌体一端长有3~6根鞭毛,鞭毛末端有的呈球状。Hp为兼性厌氧菌,但属于微需氧范围。在无氧条件下不生长,氧含量超过5%时则发育不良甚至不能生长,该菌在27℃以下及42℃以上均不能生长,最适宜温度为37℃,并要求培养罐中保持较高湿度(相对湿度98%)。Hp在培养基上形成的菌落由于培养基营养价值不同而大小各异。在哥伦比亚琼脂上菌落较大,可达2mm左右,在其它培养基上均为1mm左右的小菌落,菌落为圆形,略平、光滑或稍暗淡、无色、半透明状、无粘性、有时可见有狭窄的模糊不清的溶血环,无特殊气味。本菌生化反应主要表现为尿素酶阳性、过氧化氢酶阳性,氧化酶阳性、磷酸酶阳性。不利用糖类、不分解马尿酸、靛基质和硝酸盐还原试验均为阴性。

  Hp对多种抗生素均显示高度敏感染,其最小抑菌度为:氨苄青霉素0.5ml/L,amoxycillin0.25ml/L,红霉素0.25ml/L,青霉素1mg/L,四环素10g/L,庆大霉素10g/L,metronidzole5g/L,rimcthoprin2.5g/L,萘啶酸30g/L,但本菌对多粘菌素B、二性霉素、吡呱酸、万古霉素等耐药。对某些中药如黄柏、黄莲、黄芩等亦显示敏感。

  2.1 动物实验

  5只健康成年狗实验前内镜及活检病理组织学检查,胃粘膜基本正常,Hp尿素酶快速诊断培养及切片染色均为阴性。接种Hp1周后有3只狗内镜及活检胃粘膜有浅表胃炎症改变,切片W-S染色发现少数Hp、尿素酶及Hp培养亦为阳性反应,其中两只持续3周,一只3周以后胃粘膜炎症消失,Hp转阴。另两例灌注菌液前后内镜检查胃粘膜正常,Hp试验阴性。

  10只大白鼠及10只小白鼠前后各阶段检查胃粘膜均基本正常,Hp检查阴性。

  3 讨论

  本文材料显示兰州地区群胃粘膜中Hp的检出率很高,与粘膜的病理组织学炎症和消化性溃疡密切相关,这些结果与国内外一些报道基本一致,尿素酶试验培养及组织学切片检查对Hp检出率几乎同样敏感。一般认为使用特殊的W-S染色是检查Hp的较好方法,细菌是紫色,很容易辨认,但操作烦琐费时。我们用HE染色达到了与前者几乎同样的效果,部分病用革兰染色也能清楚显示Hp存在。对Hp的识别主要利用其形态学、生物学特片及特殊的生长环境。其生化反应主要表现在尿素酶及氧化酶双相阳性,但变形菌也可产生尿素酶,可呈尿素酶阳性反应,而氧化酶阴性。我们采用“双快试验”对于鉴别Hp与变形菌的污染,提供了一项新方法。

  为了回答Hp究竟是胃部疾患的病原菌还是共生功生菌、机会菌的问题,近年来国内外临床工作者、病理学家和微生物学家密切配合进行了大量临床及实验研究,结果表明,胃内Hp的存在与胃粘膜炎症程度呈正相关,而相对正常胃粘膜、胃癌、萎缩性胃炎及肠化病胃标本中Hp检出率很低。我们的动物实验表明,5只成年狗实验前胃粘膜正常,Hp阴性。在灌注Hp菌液1周后,有3只胃粘膜发生炎症改变,Hp检查阳性。其中两只持续3周、一只持续4周以后,胃粘膜相继恢复正常,Hp亦转为阴性,说明Hp对胃炎致病因素可能有关。10只大白鼠、10只小白鼠灌注菌液前后胃粘膜无明显改变,Hp检验阴性。是否Hp对啮齿类动物无致病性,值得进一步研究。

  病理组织学染色观察,Hp主要位于胃窦粘膜的粘液层下,常聚集成团,在胃体食管及十二指肠粘膜中有时也发现少数Hp存在,但检出率远低于胃窦粘膜。观察结果还表明,在同一病例中胃窦粘膜Hp检查阳性,而溃疡及癌组织中Hp常为阴性,说明Hp不易在溃疡及组织存在。

赵世民1 梁守德1 梁玉珍1 张学忍2 贺建平2 何志龙3

1兰州军区总医院消化科

2兰州军区总医院检验科

3兰州军区总医院病理科(兰州 730050)


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