弗劳地枸橼酸盐杆菌基因种与小儿腹泻关系、耐药性的研究

　　中国微生态学杂志2000年第12卷第1期

张乐海　马丽霞　傅云霜　高华英　许国生

　　 摘　要：从1457例腹泻患儿大便中分离出164株(11.25%)弗劳地枸橼酸 盐杆菌复合群的菌株，而对照组中分离率仅4.26%，具统计学差异(P＜0.05)。为探讨其致病性，采用不耐热性肠毒素(LT)、耐热性肠毒素(ST)基因探针，菌液直接LT-PCR，家兔肠袢结扎和刚果红结合试验检测细菌的腹泻毒力因子，证实47.1%的菌株产生LT，系腹泻重要毒力因子，不具侵袭性因子。LT阳性菌株见于C.freundii,C.braakii,C.werkma nii。初步认为弗劳地枸橼酸盐杆菌与小儿腹泻密切相关，耐药性检测表明10%的菌株产生超 广谱β-内酰胺酶。

　　关键词：弗劳地枸橼酸盐杆菌　基因种　不耐热性肠毒素　超广谱β-内酰胺酶

　　弗劳地枸橼酸盐杆菌隶属肠杆菌科枸橼酸盐杆菌属。常常分离自婴幼儿腹泻粪便中，然而， 通常认为该菌系肠道的正常寄留菌。早先，曾报告该菌与人类肠炎有关^［1，2］， 1987年Alfredo等分离出产生耐热性肠毒素的菌株^［3］。我们在检测腹泻患儿的肠 道致病菌时，从1457例腹泻患儿粪便中分离出了164株弗劳地枸橼酸盐杆菌，为探讨该菌与 小儿腹泻的关系，随机抽取了40株细菌采用不耐热性肠毒素(LT)、耐热性肠毒素(ST)基因探 针行菌落原位杂交试验，菌液直接LT-PCR试验，证实部分菌株具LT基因且产生LT毒素，初步 认为弗劳地枸橼酸盐杆菌与小儿腹泻有一定关系。并对其耐药性进行了分析，现报告如下：

　　1　材料与方法

　　1.1　检测对象　系我院肠道门诊和住院腹泻患儿，共计1457例，其中门诊 病例1147例，住院病例310例。正常婴幼儿94例。

　　1.2　细菌分离鉴定　腹泻患儿新鲜大便接种SS琼脂，35℃过夜培养 ，挑取不发酵乳糖、中心黑色的菌落接种GYZ-15e生化反应管(批号960918，浙江省军区后勤 部卫生防疫检验所提供)。凡生化反应符合弗劳地枸橼酸盐杆菌的细菌，按Brenner^{［4 ］}等的方法鉴定基因种。同一标本用相应方法分离鉴定致泻大肠杆菌、空肠弯曲菌、耶尔 森菌、气单胞菌、邻单胞菌、沙门菌、志贺菌，以ELISA方法检测轮状病毒。

　　1.3　腹泻毒力因子试验　菌株来源及生化反应见文献^［5］。

　　1.3.1　基因探针菌落原位杂交试验　LT、ST基因探针购自第一军医大学。杂交 方法严格按照说明书进行，并设有阳性和阴性对照。

　　1.3.2　菌液直接LT-PCR试验　引物购自第一军医大学流行病学教研室。反应体 系为50μl,10× Buffer 5μl，菌培养液(6h)10μl；Taq酶1.5μl，无菌石腊油50μl，离 心1000转/min，上机扩增，95℃变性10min，94℃变性1min，56℃复性1min，72℃延伸1min3 0sec，35个循环最后72℃延伸10min。取PCR扩增产物10μl，1.5%琼脂糖凝胶电泳，加溴酚 兰3μl，稳压80V，电泳40min，紫外灯下观察结果并拍照。

　　1.3.3　家兔肠袢结扎试验　按文献^［6］方法检测，积液量与肠段长度 之比(ml/cm)作为毒素活力指标，大于等于1.0为阳性，以ETEC129为阳性对照(上海市卫生 防疫站惠赠)。

　　1.3.4　刚果红结合试验　按Payne^［7］等的方法进行。以福氏志 贺菌作对照。

　　1.4　耐药性检测　采用Bauer-Kirby方法检测对β-内酰胺类抗生素的耐药 性，凡是对一代、二代、三代头孢菌素耐药或中介度的菌株，用E-test方法和Sander^{［ 8］}方法检测超广谱β-内酰胺酶(ESBL)和诱导型β-内酰胺酶。

　　2　结　果

　　2.1　流行病学和临床特征

　　1457例腹泻患儿大便中检出164株弗劳地枸橼酸盐杆菌，阳性率11.25%，正常幼儿大便阳性 检出率4.26%，具统计学差异(P＜0.05)。在检出弗劳地枸橼酸盐杆菌164例患儿中，同时 检出14株其它的病原菌，包括9株奇异变形杆菌，2株铜绿假单胞菌，1株嗜水气单胞菌和2例 轮状病毒阳性。

　　164例患儿中，男98例，女66例，最小者20天，最大者11岁，小于1岁者96例(58.3%)，其中 3月～11月的占75%，1～2岁者22例(13.4%)，大于2岁者46例(28.0%)。据资料完整的54份 病历 分析，其临床特征为：多为低热(85.7%)，腹泻次数多为(4～7)次/日(78.3%)，个别高达2 0次 ，47.8%的病例为黄水稀便，42.7%的病例为黄稀便带少量脓血。76.2%的病例检出白细胞 ，57.1%的病例红、白细胞并存。

　　2.2　毒力试验结果

　　2.2.1　基因探针杂交结果　对40株细菌(27株C.freundii,4株C.youngae,6 株C.braakii,3株C.werkmanii)进行杂交，结果全部菌株ST阴性。LT阳性率37.5%，其中13 株为C.freundii,1株C.braakii,1株C.werkmanii。

　　2.2.2　菌液直接PCR试验　共试验34株细菌，结果阳性率47.1%，见图1。

图1　LT-PCR试验结果

　　2.2.3　家兔肠袢结扎试验　共试验8株细菌，均为基因探针和PCR试验阳性 的菌株，结果见图2、表1。

表1　家兔肠结扎试验结果

图2　肠结扎试验(剖腹后，阳性肠段明显肿胀 ，充有大量血性液体)

　　2.2.4　刚果红结合试验　所试菌株共40株，均为阴性，菌落无色，阳性对照(福氏志贺菌)菌落红色。

　　2.3　耐药性检测结果　对上述40个菌株进行β-内酰胺类抗生素耐药性检测，发 现有5株对氨苄青霉素、苯唑青霉素、氧哌嗪青霉素、一代二代三代头胞菌素(头胞三嗪、头 胞他啶、头胞噻肟、头胞哌酮)、氨曲南全部耐药，疑为ESBL菌株。以E-test方法检测，有4株确为ESBL菌株，见图3。另外1株为非ESBL菌株，也不产生诱导型超广谱β-内酰 胺酶，无抑菌环截平现象，见图4。

图3　ESBL检测结果图3(a、b、c)均为C.freundii,TZ/TZL比值分为7.89、

　　7.89、 10.5,图3d为C.werkmanii,其TZ/TZL比值为32

图4　诱导型超广谱内酰胺酶检测

　　3　讨　论

　　关于枸橼酸盐杆菌与小儿腹泻的关系，目前还不清楚，早在1946年和1959年Barnes^{［1 ］}等和Baylet^［2］等及Wadstrom^［9］分别报告枸橼酸盐杆菌与人类肠炎 有关，但其相关性没作祥尽的描述，直到1980年证明大肠埃希菌和一些非大肠杆菌通过LT 或/和ST引起腹泻以后^［10］，人们开始注意该菌是否产生这两种毒素。Alfredo ^［3］等对意大利那不勒斯地区328例小儿腹泻大便中分离的46株枸橼酸盐杆菌进行研 究发现，6.5%的菌株产生ST，而在对照组枸橼酸盐杆菌的分离率仅6.5%，且无ST阳性菌株 。本研究中用LT和ST基因探针进行检测，发现37.5%的菌株具LT基因，LT-PCR试验的阳性率 是47.1%，家兔肠袢结扎试验表现阳性肠段明显肿胀，充有血性粘液，与阴性对照具明显区 别，充分说明我们分离菌株产生LT，但未发现ST阳性菌株，与意大利菌株在致病机理上有所 不同。LT阳性菌株不仅见于C.freundii,而且也见于C.braakii、C.werkmanii。

　　在临床流行病学调查中发现枸橼酸盐杆菌的分离率明显高于对照组，且具有统计学意义。在 LT所有阳性的病例中其临床特征与肠炎特征一致，其腹泻为水样便、脓血便，镜检有白细胞 或/和红细胞，这些病例均未发现其它致病菌。初步认为枸橼酸盐杆菌是小儿感染性腹泻的 病原菌之一。

　　侵袭力因子是肠道菌致病的重要因素。通常采用豚鼠眼结膜试验检测，其侵袭力一般受质粒 控制，具有侵袭性质粒的细菌能够结合刚果红，失去质粒后相应的毒力丧失^［11］ ，也不结合刚果红^［12］，所以我们采用刚果红结合试验检测该菌的侵袭性。本文 所试菌株全部阴性，说明该菌不具侵袭性。

　　耐药性检测表明，12.5%的菌株对所有β-内酰胺类抗生素耐药，其耐药是由于细菌产生超广谱β-内酰胺酶所致。提醒临床医师治疗该类菌感染时谨慎使用三代头孢菌素。

　　作者简介：张乐海(1963～),男，济南市儿童医院检验科副主任，主管技师，从事小儿腹泻病原

　　菌及耐药机制研究。

　　作者单位：张乐海　济南市儿童医院，济南　250022

　　马丽霞　济南市儿童医院，济南　250022

　　傅云霜　济南市儿童医院，济南　250022

　　高华英　济南市儿童医院，济南　250022

　　许国生　济南市儿童医院，济南　250022

　　参考文献

　　［1］Barnes L A and W B A Cherry.A group of paracolon organism having ap parent pathogenicity.Am J Public Health,1946,36:481～483.

　　［2］Baylet R J and J Linahard.Paracoli bethesde (citrobacter) at escher ichia freundii en pathological Dakaroise.Bull Soc Path Exot,1959,52: 723～726.

　　［3］Alfredo Guarino,et al.Production of escherichia coli STa-like heat-stable enterotoxin by citrobacter freundii isolated from humans.J Clin microbi ology,1987,25(1):110～114.

　　［4］Brenner D J,et al.Classification of citrobacteria by DNA hybridiza tion: designation of citrobacter farmeri sp.nov.,citrobacter youngae sp.nov.,citrobacter brsskii sp.nov.,citrobacter werkmanii sp.nov.,citrobacter seldl akii sp.nov.,and three unnamed citrobacter genomospecies.Int J Syst bacteriol,1993,43:645～648.

　　［5］张乐海，等.弗劳地枸橼酸盐杆菌复合群基因种的生化鉴定.中国微生态学杂志，1998，10(2)：106.

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