探讨乙型肝炎病毒(HBV)基因组存在前-X基因. 乙型肝炎病毒(HBV)基因组内部结构基因与编码基因之间相互重叠，是基因组序列高度集中利用的一个典型. 早期研究中确定了编码病毒蛋白的4个开放读码框架(ORF)，本研究通过对于中国HBV感染者的流行病毒株的基因序列进行分析比较，阐明基因组结构的特点，并探索是否存在新型ORF的可能性.
考虑到HBV基因组序列的准种特点以及多聚酶链反应(PCR)技术的精确度，我们采用的技术是长距离且精确PCR(LA-PCR)技术，根据中国HBV患者的病毒基因序列设计PCR扩增用引物，自慢性HBV感染患者外周血血清中扩增HBV基因组序列，克隆入pGEM Teasy质粒，挑选克隆进行全基因组DNA测序，与其他HBV基因组序列进行比较.
测序结果提示来源于2个患者的5株HBV全基因组核苷酸序列在X基因之前存在一ORF，我们命名其为前-X(pre-X)区. 前-X区编码氨基酸与X蛋白融合表达， 该编码序列仅在adr血清型中有编码表现.
在HBV基因组中存在有一新的ORF，命名为前-X区，该区可能是一种HBV血清型特异性编码区.
乙型肝炎病毒(HBV)基因组全长3 200个核苷酸(nt)左右，为部分双链DNA病毒. Galibert et al [1,2]于1979年发表了HBV基因组的第一个全长核苷酸序列，长度为3 182 nt，血清型为ayw亚型，我国学者[3-5]于1984年报道了中国大陆流行的adr亚型全序列. Galibert et al [1]最初的研究将HBV基因组划分出4个开放读码框架(ORF)，分别命名为S、C、P、X区. 1990年Loncarevic et al [6]克隆了一株adr血清型的HBV基因组，发现了前-X基因，并初步认为是adr血清型特异性的一段序列.Takahashi et al [7]于1995年的初步研究认为前-X区变异与肝细胞癌(HCC)的形成有关，之后在1998年发表[8]的研究报告中发现来源于HCC患者的40个全HBV基因序列中，有18株具有前-X基因，且均为adr血清型.我们应用长距离并且精确PCR技术(long and accurate PCR，LA-PCR)研究了乙型肝炎患者血清中存在的HBV病毒子基因组，证实前-X基因存在于中国大陆流行HBV株中.
应用的LA-PCR试剂成套试剂均购自日本Takara公司，pGEM Teasy载体、玻璃奶试剂、和琼脂糖凝胶为Promega公司产品，细菌JM109为本室保存，蛋白酶K为Merck公司产品，酚、氯仿、氨苄青霉素、X-gal等均为国产试剂.
1.2 方法
1.2.1 HBV全基因组的克隆与测序 见文献[9,10]. 简言之，自诊断为病毒性肝炎，乙型，慢性[11]的2例患者采集静脉血，蛋白酶K消化-饱和酚: 氯仿(1∶1)抽提法提取200 mL血清中的HBV DNA. 参考文献[12,13]中改进的全长HBV基因组扩增方法，设计引物为P1:5- CCG GAA AGC TTG AGC TCT TCT TTT TCA CCT CTG CCT AAT CA-3，P2: 5- CCG GAA AGC TTG AGC TCT TCA AAA AGT TGC ATG GTG CTG G-3. PCR法扩增目的片段. 玻璃奶法回收PCR产物，与pGEM Teasy载体连接.将重组质粒转入细菌JM109. 选择经鉴定pGEM Teasy内插入3.2 kb产物的菌落送检测序，由上海博亚公司完成.测序结果存入美国国立卫生院GenBank中. 1.2.2 核苷酸序列分析 应用DNA SIS对获得的5个克隆进行了ORF判读，并将推断的ORF翻译为氨基酸序列，应用Vector 6.0版软件对推定的ORF核苷酸序列与氨基酸序列与已经存储在GenBank中不同血清型的HBV核苷酸与氨基酸序列进行比较，血清型包括: adr[4,14]、ayr[15]、adw2[6]、adw4和ayw[1]. 1.2.3 前-X区氨基酸序列比较 在美国国立卫生院(NIH)生物工程信息中心建立的门户网站，应用BLAST软件，以本研究证实的G683-A2编码的前-X区氨基酸序列进行搜索，以寻找存储于GenBank中的表达前-X区基因的克隆.另将该段氨基酸序列在Vector 6.0版软件进行疏水性分析.
HBV基因组核苷酸序列的测定 以2例乙型肝炎患者血清中抽提的HBV基因组为模板，应用LA-PCR-TA克隆方法，将实际存在的HBV基因组克隆到测序载体中. 经验证后，选择5个克隆测序，分别命名为G683-A1、G683-A2、G683-A3、G376-A6和G376-A7，获得的HBV基因组核苷酸长度分别为3 215、3 182、3 213、3 215和3 125 nt. 测序结果存入美国国立卫生院的GenBank中，序列号为AF363961、AF363962、AF363963、AF384371和AF384372. 2.2 核苷酸序列的分析 5株克隆之间的比较提示: G683的3株克隆之间的同源性为97.5 %，G376的2株克隆之间的同源性为96.6 %. 按照Galibert et al [1]最初定义的X区分析5株克隆的X区ORF，4株克隆编码155 aa，一株由于发生终止密码子的替换突变，导致编码长度延长至179 aa. 应用DNA SIS软件对上述5个克隆的ORF再分析过程中，发现在5株克隆的X区的上游均有一ORF，该区长168 bp，与X基因融合表达. 我们为了排除选择样本的误差，在GenBank中选择不同血清型的全基因序列进行比较，选择的GenBank序列号为:D12980 (adr[11]): 3 215 bp; G329616 (adr[4]): 3 221 bp; X04615(ayr[12]): 3 215 bp; X02763 (adw2[13]): 3 221 bp; Z35717 (adw4):3 221 bpG329640 (ayw[1]): 3 182 bp. 结果发现克隆株G329616存在前-XORF.X04615在前-X区第一起始密码子ATG处由于核苷酸的替换突变而成为TTG，克隆X02763Z35717和G329640在前-X区第一起始密码子ATG均编码CTG，因此不表达前-X多肽. 另一adr亚型克隆D12980在第一起始密码子ATG无替换突变，但在第二起始密码子ATG之前出现替换突变，而终止了前-X多肽的表达.2.3 氨基酸序列的较 前-X多肽氨基酸残基(aa)序列比较结果见图1（略）. 新的ORF长度为168 bp，编码56个aa，克隆G683-A2编码的前-X基因推断的氨基酸残基序列为: MGLGYWPSPPAWNLCGSSADPYCGTPSSLFC SQPVWSETYRNRQLCCPLSEIHLLS.G 683的3个克隆在第10位编码脯氨酸(P)，G376的2个克隆与克隆G329616编码组氨酸(H); G683的3个克隆在第38位均编码谷氨酸(E)，而G376的2株克隆与克隆G329616编码为赖氨酸(K). 以G683-A2编码的前-X多肽分析，该多肽Mr 6 200，有15个疏水氨基酸残基，24个极性氨基酸残基，5个半胱氨酸(C). 此外，该多肽还包含7个亮氨酸(L)，分别位于第3、14、29、45、49、54、55位，以及9个丝氨酸(S)[16].
在美国国立卫生院(NIH)的门户网站，应用BLAST软件，以G683-A2前-X区编码的推断氨基酸序列进行搜索，发现存储的19 (18)个克隆有前-X区多肽序列，氨基酸序列同源性为85-94 %.
[1]首次将HBV基因组全序列测序并发表出来，当时即定位了4个ORF，分别为C、P、S、X区.之后我国学者[3,4]于1980年代解读了大陆HBV流行株(adr)的全基因序列. 目前在美国国立卫生院的GenBank中，存储了200多HBV全基因组序列，但多数学者对4个ORF分区的界定并无异议. 本研究利用LA-PCR-以TA克隆-测序技术展示了同一患者来源的HBV基因组不同克隆之间的变异程度，G683的3株克隆之间的同源性为97.5 %，G376的2株克隆之间的同源性为96.6 %，证明患者血清内的序列是不完全相同的，符合准种表现.本研究其他报道[17-25]证实了近年其他学者[26-31]提出的HBV准种假说. 本研究在分析所获得的5个克隆的过程中，在X区之前发现还存在一个ORF，长度168 bp，编码56 aa. 以G683-A2编码的前-X多肽分析，该多肽Mr 6 200，有15个疏水氨基酸，24个极性氨基酸.应用DNA SIS软件的蛋白质分析功能分析了前-X和X基因的完全表达产物，前-X区较以往认为的X蛋白多出一个小的亲水区. 前-X区编码多肽含有5个C，可能形成多个二硫键，易于产生新的二级结构. 如果该区被证明是真实存在的，那么前-X和X蛋白(我们初步命名其为全X蛋白)与X蛋白有不小的差异. 前-X多肽含有24个极性氨基酸，形成一个亲水功能域，可能影响到整个蛋白的空间构象. 在对我们获得的5个克隆与甘人宝et al [4]报告的前-X多肽进行比较时发现，G683的3个克隆在第10位编码P，G376的2个克隆与克隆G329616[4]编码H; G683的3个克隆在第38位均编码E，而G376的另3个克隆编码K.这印证了我们[32,33]以前的关于HBV在不同患者体内存在个体化变异的报告. 我们应用了2种方法来证实前-X区的真实存在. 方法一是在GenBank中选择不同血清型的HBV基因组全序列，应用DNA SIS软件重新确定其ORF，结果发现甘人宝et al [4] (1984年)揭示的HBV基因组序列中存在前-X区ORF. 其他亚型不表达前-X区多是由于前-X区起始密码子ATG发生替换突变所致，其他亚型的克隆表现为TTG (X04615)，或CTG (克隆X02763、Z35717和G329640). 另一adr亚型克隆D12980保留了第一起始密码子ATG，但在两个起始密码子之间由于发生替换突变，而终止了前-X多肽的表达.初步推定前-X区起始密码子处发生的替换突变可能是血清型特异性的. 方法二是利用NIH网站的BLAST软件，将前-X区编码氨基酸序列输入后进行同源性搜索，结果发现已经存入GenBank中的序列中，有19个克隆中含有的氨基酸序列与本研究获得的序列有较高的同源性，分别为来自2组报道，其中2个克隆是来自同一序列的不同解释，另17个克隆均来自日本学者[8]对肝细胞癌(HCC)患者体内存在的HBV基因组分析所获得. 我们克隆的氨基酸序列与18例相关克隆的比较，发现同源性为85-94 %. 这些克隆的共性为: 一均为adr亚型; 二均克隆自HCC患者.综合上述2种方法证实的结果以及我们的资料，可以肯定前-X区是实际存在的. 我们认为多种资料的研究结果证明前-X区是事实存在的，以往的研究认为该区的编码并不是一种普遍现象，因而未加以重视. Zuckrman et al 或其他教科书均未提及前-X区的存在，仍沿用Gelibert et al建立的ORF划分方法.我们分析的结果提示具有前-X区的HBV克隆株多来自日本和中国，且均来自adr亚型，而欧美学者由于选择的样本误差可能是忽视了该区域的主要原因. 另外，由于目前仍缺乏对HBV的大规模分子流行病学资料，因此早期发现前-X区的学者[6]可能认为一些位点发生变异，而不认为这是一种主流现象，因而未得到重视[34].早在1990年Loncarevic et al [6]自HCC患者血液中克隆的adr亚型的HBV基因组中提及了前-X区，作者简单介绍了前-X区的存在; Takahashi et al [7]于1995年的研究结果认为前-X区与HCC有密切关系. 1998年，Takahashi et al [8]自HCC患者体内克隆了40株HBV全序列，其中38株为adr亚型，其中18株含有前-X基因，作者综合以往的资料，认为前-X基因与HCC有密切的关系. 但上述资料分析的患者病例数较少，结论需要进一步推敲.我们选择的患者为慢性乙型肝炎患者，并不是HCC患者.我们搜集的24株编码前-X基因的克隆均为adr亚型，提示前-X区的存在可能是一种亚型特异性现象. 与HBV表面抗原大蛋白[35-37]一样，X蛋白是一个强的反式激活因子[38]，该蛋白反式激活作用不仅作用于病毒蛋白启动子，更可以通过与癌基因的相互作用而调控细胞的分化[39-41] . 根据Takahashi et al [7,8]的观察，该区与HCC密切相关，是否提示全X蛋白较X蛋白有更强的反式激活作用，还有待于进一步确定.根据针对前-X多肽的氨基酸组成分析，发现该区域含有多个S，可能是磷酸化的重要区域，与细胞内信号转导有关. 作为完整的基因，以前确定的4个ORF有4个启动子，分别为S启动子I、II(SP I和SP II)，X启动子(XP)和C启动子(CP)[42-45]，前-X区位于既往定义的XP区. 启动子区定义的方法目前仍沿用报告基因表达调控法[46,47]所确定，刘妍et al [48]以往的研究解释了不同准种克隆对CP的影响，我们将应用这种方法进一步确定前-X之前是否存在有新的启动子区(XP II？)，并研究HBV异质性[49]对启动子区功能的影响.总之，在HBV X基因之前存在有一融合编码的ORF，为前-X区; 如前-X多肽的表达得到进一步证实，将对HBV感染的检测、全X蛋白的功能、HBV的致癌机制的研究均会产生重大影响.我们早先的研究探讨了X蛋白[50]不同变异株的反式激活作用的强弱，下一步将探讨全X蛋白的反式激活作用.